利用內標為基礎的RT-PCR技術檢測草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)

史芳芳

(新疆兵團第十二師農業科學研究所，新疆烏魯木齊 830088)

利用內標為基礎的RT-PCR技術檢測草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)

史芳芳

(新疆兵團第十二師農業科學研究所，新疆烏魯木齊 830088)

[目的]通過對反應條件和參數的摸索與優化，建立多重RT-PCR檢測方法，實現2種病毒的同時高效快速檢測。[方法] 通過CTAB法與試劑盒提取RNA，以優質的總RNA為模板，進行梯度PCR，結合擴增內標的檢測體系，建立多重RT-PCR檢測方法。[結果] 建立了優化的SCV和SVBV的多重RT-PCR檢測體系，可以對草莓田間植株進行快速穩定的病毒檢測。[結論]該研究為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學方法，為草莓無病毒苗的實際生產提供技術支撐。

草莓病毒; 內標; 多重RT-PCR; 病毒檢測

草莓種苗普遍感染病毒是草莓生產中的瓶頸問題，由于可侵染草莓的病毒經常復合侵染，因此草莓病毒病的田間癥狀表現極其復雜[1]。不同病毒病在草莓上可表現出相似的癥狀，而同種病毒病在不同條件下的癥狀也會出現很大差異，這給病害的田間診斷帶來了極大的困難[2]。因此，建立快速、準確的草莓病毒檢測技術具有重要的實際意義。目前新疆關于草莓病毒病的研究極少，對病毒種類、分布、發生程度及生物學特性等基礎研究極為薄弱，病毒檢測體系不健全，缺乏先進的種苗及種苗生產環節有效的病毒檢測技術手段，脫毒種苗質量難以保證，退化嚴重，使用時間短，效益不高。有的生產單位未經檢測就盲目從內地調種，劣質種苗不僅破壞了脫毒種苗的聲譽，損害了農民的利益，還造成了一些病原菌的廣泛傳播和地區性的檢疫病害傳入[3]。因此，在已有試驗技術的基礎上，通過進一步改進試驗方法，優化體系，建立起一套靈敏度高、準確性好、操作簡便的病毒檢測技術[4]。筆者針對草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)2種病毒，以單一RT-PCR為基礎，通過對反應條件和參數的摸索與優化，建立多重RT-PCR檢測方法，實現2種病毒的同時高效快速檢測，為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學方法，為草莓無病毒苗的實際生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料草莓試材為新疆兵團十二師三坪農場種植的露地草莓品種達賽萊克特，此品種為該單位從外地引進，種苗未經檢測種植于大田，采集疑似感染皺縮病毒的6株草莓植株葉片，進行病毒檢測。取約50 mg幼葉為試驗材料。

1.2 試驗試劑RNA試劑提取盒、反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD2000均購于上海生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1特異性擴增與參照引物設計。根據GenBank中SMoV( Genbank Accession No.AJ311875，AJ311876)、SMYEV( Genbank Accession No.D12517)、SCV( Genbank Accession No.AY005146.1)、SVBV( Genbank Accession No.NC001725)的基因組序列和文獻分別設計和合成針對SMoV、SMYEV、SCV和SVBV 的引物( 表1)[5]。

為了驗證擴增的陰性條帶的真偽性，引用草莓肌動蛋白基因Actin( GenBank Accession No.AB116565)作為內部體系參照[6]。所用引物均由上海生物工程公司合成。引物序列見表1。

表1 SMoV、SMYEV、SVBV、SCV和Actin檢測所用引物

1.3.2核酸提取。

1.3.2.1利用改進的CTAB法提取草莓葉片總核酸[7]。取少許幼嫩葉片，放入1.5 ml離心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均勻，直至全部研磨至粉末，加入500 μl 65 ℃預熱的CTAB溶液(用前加入2%的巰基乙醇)，將裝有CTAB和樣品的EP管放入65 ℃水浴，約20 min。冷卻后，加入500 μl酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，12 000 r/min，離心15 min，吸上清，裝入一新的EP管。加入500 ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，12 000 r/min，離心15 min，吸上清，轉入一新的離心管中。加入1/10體積的NaAc(3 mol/L)，1 ml -20 ℃預冷的無水乙醇，反復顛倒數次，混勻后置于-20 ℃(-80 ℃，30 min)3～4 h，12 000 r/min，10 min，棄上清。向離心管中加入75%的乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干。加入DEPC H2O(30 μl)溶解。

1.3.2.2試劑盒提取總RNA。總RNA的提取參見試劑盒說明書進行。

1.3.3反轉錄。按照試劑盒說明書進行反轉錄。

1.3.4梯度PCR擴增內參。以反轉錄產物為模板，進行單一PCR擴增。PCR體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 1 μl，Taq酶0.5 μl，反轉錄產物0.5 μl，補足雙蒸水至20 μl。

反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 40 s，68 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.3.5多重RT-PCR。

1.3.5.1雙重RT-PCR擴增SCV。擴增體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 0.5 μl，SCVF/SCVR 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，反轉錄產物0.5 μl，補足雙蒸水至20 μl。

反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.3.5.2三重RT-PCR擴增其他3個病毒。擴增體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物SMoVF/SMoVR 0.72 μl，SVBVF/SVBVR 1 μl，SMYEVF/SMYEVF 0.6 μl，Taq酶0.5 μl，反轉錄產物0.5 μl，補足雙蒸水至20 μl。

反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。

2 結果與分析

2.1 總核酸分離和電泳檢測采用試劑盒提取總核酸，包括總DNA和總RNA。從瓊脂糖凝膠電泳結果可以看出(圖1)，DNA條帶及RNA的28S、18S和5S條帶均能看到，這說明總RNA沒有發生降解，完整性較好。

2.2 內標RT-PCR以ActinF/ActinR為引物，采取草莓品種反轉錄產物為模板，梯度PCR擴增，篩選出53°為最佳退火溫度，擴增出預期295 bp大小的特異片段(圖2)，說明Actin基因存在于草莓中，該基因適合作為草莓RNA病毒檢測的內標。以此基因為內標，一方面可以排除假陰性結果的干擾，另一方面可以進一步檢測RNA質量，提高了檢測結果的準確性。

2.3 多重RT-PCR以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR兩對引物首先擴增疑似皺縮病毒，擴增條件同Actin基因，2個植株擴增出大小為345 bp的特異片段(圖3)，說明檢測出SCV病毒，此前預估帶有此病毒的推測是正確的。

同時，以另外3種病毒引物繼續擴增cDNA，確定植株是否還有其他病毒侵染，結果檢測出片段大小278 bp的條帶，說明存在鑲脈病毒侵染(圖4)，因此疑似植株可確定為皺縮病毒和鑲脈病毒復合侵染，與皺縮病毒通常與草莓鑲脈病毒(SVBV)復合侵染的說法一致。

圖1 總核酸提取

圖2 6個植株內參Actin 擴增

注：M.marker，A1、A2.Actin擴增條帶，S1、S2.SCV擴增條帶。圖3 Actin/SCV引物擴增

注：M. marker， 1、2.SVBV擴增條帶。圖4 其他3引物擴增

3 討論

(1)與改進CTAB法提取RNA 相比，該研究采用試劑盒提取，方法簡單，只需30 min，提取效果也比改進的CTAB法好，而且改進的CTAB法提取配制試劑復雜，準備工作耗時長，對所用耗材及試劑要求均必須去除RNA酶污染，提取時間需要12 h，提取過程也較繁瑣，一批次提取樣品，提取效果均一性不好，有些樣品提取條帶完整，有些則效果較差，這說明提取過程稍不注意，則會有RNA酶污染，影響了提取效果[8]。

(2)植物病毒檢測體系中引入內標可增加試驗的可靠性，減少假陰性的出現。該研究設計了NADH脫氫酶基因為內參，合成引物后，經過多次條件摸索，始終擴增不出內參條帶，之后換成Actin內參引物，經過梯度PCR擴增，一次便成功擴增出條帶，該研究最終選擇此基因作為內參，擴增效果較好，健康植株與帶毒試材均可良好地擴增，說明此內標相對穩定[9]。

(3)多重PCR擴增受諸多因素影響，該研究首先以疑似病毒引物和內參引物作雙重PCR擴增，確保了樣本RNA質量的可靠性，同時驗證了疑似病毒的檢測結果，2次試驗再進行三引物PCR擴增，以排除其他病毒的侵染，2次試驗便可確保試驗的準確無誤，避免了單一引物擴增的繁瑣性，因此，經過多重RT-PCR擴增可縮短試驗時間，減少試劑的損耗，達到了省時省力的功效。同時，該研究在試驗過程中嘗試了采用一步法RT-PCR進行擴增，此方法可節省更多的時間和試驗步驟，但此方法中間過程不易控制，且重復性不好，因此沒有得到較好的試驗結果，最終還是選擇兩步法PCR更能保證試驗的準確性[10]。

[1] 王國平.我國草莓病毒種類鑒定研究初報[J].中國果樹，1988(2)：32-34.

[2] 肖君澤，黃益鴻，姜放軍，等.草莓病毒病及其脫毒與檢測技術研究進展[J].江西農業學報，2010，22(8)：88-90.

[3] 常琳琳，張志宏.草莓病毒的簡單、快速PCR檢測[M]//中國園藝學會草莓分會，北京市農林科學院.草莓研究進展(三).北京：中國農業出版社，2009：83-88.

[4] 楊洪一，張志宏，李麗麗，等.利用多重RT-PCR技術檢測草莓病毒的研究[J].植物病理學報，2007，37(5)：549-552.

[5] 隨春，吳祿平，張志宏.利用PCR技術檢測草莓鑲脈病毒[J].園藝學報，2003，30(1)：82-84.

[6] 朱海生，花秀鳳，陳敏氡，等.四種草莓病毒SMoV、SVBV、SCV、SMYEV多重RT-PCR檢測[J].核農學報，2013，27(11)：1630-1635.

[7] 張志宏，楊洪一，代紅艷，等.應用多重RT-PCR檢測草莓斑駁病毒和草莓輕型黃邊病毒[J].園藝學報，2006，33(3)：507-510.

[8] 王紅，王菁菁，張科立，等.利用內標為基礎的多重RT-PCR 技術檢測草莓斑駁病毒和草莓輕型黃邊病毒[J]．浙江農業學報，2014，26(1)：105-109．

[9] 楊洪一，張志宏女，杜國棟，等.利用內標為基礎的RT-PCR技術檢測草莓斑駁病毒[J].植物病理學報，2005，35(2)：116-122.

[10] 陳曉軍，王敬東，馬洪愛，等.利用RT- PCR 對脫毒草莓苗病毒檢測研究[J].北方園藝，2010(23)：146-148.

Detection of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on Internal Control

SHI Fang-fang

(The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi,Xinjiang 830088)

[Objective] Through optimization of reaction conditions and parameters, multiple RT-PCR detection method was established in order to realize efficient and rapid detection of two kinds of virus. [Method] By CTAB method and the kit, RNA was extracted. Using high-quality total RNA as a template, gradient PCR was done, Combining with internal amplification target detection system, a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established. [Result] A multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established, and could make fast and stable virus detection in field grown strawberries. [Couclusion] The study provided a convenient and efficient molecular biology method for strawberry virus detection, and provided technical support for actual production of strawberry virus-free seedling.

Strawberry virus; Internal control; Multiplex RT-PCR; Virus detection

新疆生產建設兵團科技支疆計劃項目(2013AB006)。

史芳芳(1977-)，女，新疆烏魯木齊人，助理研究員，碩士，從事植物組織培養及農業技術推廣工作。

2015-08-07

S 41-33

A

0517-6611(2015)28-020-02