星點設計-響應面法優化黔產金櫻子多糖超聲提取工藝*

晏建新，王曉麗

(1.貴州醫科大學藥學院，貴陽 550004；2.貴州省人民醫院藥劑科，貴陽 550001)

星點設計-響應面法優化黔產金櫻子多糖超聲提取工藝*

晏建新1，2，王曉麗1

(1.貴州醫科大學藥學院，貴陽 550004；2.貴州省人民醫院藥劑科，貴陽 550001)

目的 優化黔產金櫻子多糖的超聲提取工藝和條件。方法 以液料比、提取時間和提取溫度為自變量，以黔產金櫻子多糖的提取率為因變量，對自變量各水平進行多元線性回歸和二項式擬合，采用響應面法優選工藝條件，并進行預測分析。結果 黔產金櫻子多糖優選工藝：液料比30：1( mL：g)，提取時間60 min，提取溫度75 ℃，平均提取率37.54%。結論 優化的超聲提取工藝和條件簡便可靠。

金櫻子，黔產；多糖；超聲提取； 星點設計-響應面法

金櫻子為薔薇科植物金櫻子(RosalaevigataeMichx)的干燥成熟果實[1]，在我國西南、華南、華中、華東均有分布，尤其以貴州省分布廣，產量高[2]。金櫻子主要活性成分為金櫻子多糖(RosaLaevigataeMichx polysaccharide,RP)，鑒于多糖具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗衰老等藥理作用[3]。響應面法( response surface methodology，RSM) 是利用合理的試驗設計方法并通過實驗得到一定數據，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來優選工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法[4]。星點設計(central composite design，CCD)是近年常用的設計方法，星點設計-響應面法(CCD-RSM)比正交實驗法更加簡化，比均勻設計法更加全面，其實驗次數較少，實驗精度高[5]，在中藥提取中也有重大應用[6-7]。本實驗引入CCD-RSM對金櫻子多糖的超聲提取工藝進行優化，通過實驗測定金櫻子多糖提取率，優選超聲提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料 金櫻子采自貴州省遵義縣團溪鎮，經貴州醫科大學藥學院王曉麗教授鑒定為薔薇科植物金櫻子的成熟果實。葡萄糖標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904)，濃硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純，水為重蒸水。

1.2 儀器 SK3300H型超聲清洗儀(上海超聲設備有限公司)，UV-2401型紫外分光光度計(日本津島)，FA2004分析天平 (上海舜宇恒平科學儀器有限公司，感量：0.1 mg)，HH-2恒溫數顯水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.051 6 g，置100 mL量瓶中溶解后定容，搖勻后濃度為0.516 mg·mL-1。

2.2 供試品溶液的制備 金櫻子樣品處理后置60 ℃恒溫烘箱中烘干，自然冷卻后粉碎過內徑0.250 mm(60目)篩，干燥后[8]備用。稱取上述干燥后樣品按一定比例加重蒸水按不同條件超聲提取[9]，濾過。取續濾液，稀釋一定倍數，備用。

2.3 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別置50 mL量瓶中，均稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取上述溶液2.0 mL置具塞試管中，各加4%苯酚1 mL，混勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，混勻，置40 ℃水浴中加熱30 min，取出后冰水浴中放置5 min，在波長490 nm測吸光度[9]，進行線性回歸，得回歸方程：Y=12.337X+ 0.090 2，r=0.999 0，其中Y為溶液質量濃度(mg· mL-1)，X為吸光度。線性范圍為5.16～25.80 μg·mL-1。

2.4 金櫻子多糖的測定 準確稱取金櫻子的粉末0.5 g，按“2.2”項下方法操作。精密吸取供試品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，雙蒸水定容，搖勻，精密量取2.0 mL于具塞試管中，按“2.3”項下方法操作，在490 nm測吸光度。多糖提取率(%) =C×V/W×100，式中：C：金櫻子提取液中葡萄糖濃度(mg·mL-1)；V：提取液總體積(mL)；W：金櫻子干粉質量(mg)。

2.5 提取工藝優化

2.5.1 星點設計試驗設計 通過Design-Expert7.0.0版軟件，根據星點設計原理，每因素五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示三因素，α=(23)1/4，以液料比、提取時間和提取溫度為自變量，金櫻子多糖提取率為因變量進行優化，實驗因素水平表見表1，實驗安排見表2。

表1 實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of the experiment

2.5.2 等高線圖和響應面圖分析 通過響應面優化實驗分析可以得到相應的響應面圖。響應面圖可以直觀地反映各自變量對多糖提取率的影響以及各自變量之間交互影響的強弱關系[10]。實驗結果見響應面曲面圖及等高線圖，見圖1～3。

表2 星點設計優化實驗方案與結果

Tab.2 Optimization and results of central composite design

編號X1X2X3多糖提取率/%1001.73232.92211135.08301.732033.09400035.22511-128.94600-1.73224.517-11126.888-11-127.029-1.7320024.08101-1130.4611-1-1126.36121-1-127.5813-1-1-125.031400037.031500036.781600036.46171.7320032.261800036.271900037.85200-1.732025.04

從圖1～3可以直觀地看出：料液比對貴州產金櫻子多糖提取率的影響最大，其描繪得到的曲線較為陡峭；其次是提取時間的影響，其曲線相對于料液比而言，相對平滑一些；影響最小的是溫度，其曲線平滑，反映出的數值變化不大。按照回歸模型預測的超聲提取貴州產金櫻子多糖的優選工藝條件是：液料比為35.64(mL：g)，提取時間為64.29 min，提取溫度75.01 ℃。在此工藝條件下，預測提取得到貴州產金櫻子多糖提取率為37.83%。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖1 液料比與提取溫度對多糖提取率的交互影響

Fig.1 Interation of ratio of water to material and temperature on polysaccharide yeild

圖2 提取時間與液料比對多糖提取率的交互影響

Fig.2 Interation of time and ratio of water to material on polysaccharide yeild

圖3 提取時間和提取溫度對多糖提取率影響的交互影響

Fig.3 Interation of time and temperature on polysaccharide yield

2.5.3 驗證實驗 在優選出的工藝條件下，進行多次實驗取平均值，再與數學模型預測值進行比較，其中實驗值與預測值的偏差表示實驗值偏離預測值的程度，其絕對值越小，說明預測性越好[11-16]。采用上述優選提取條件 (考慮到實際操作的情況，將多糖優選提取條件修正為料液比1：30、超聲時間為60 min、超聲溫度75 min)，在此工藝條件下重復操作3次實際測得的平均多糖得率為37.54 %，與模型預測值的誤差為0.8%。

3 討論

利用響應面設計對影響金櫻子多糖提取的各自變量進行了評價，影響程度：料液比>超聲時間>超聲溫度。利用Dsign-Expert7.0.0版軟件對進行響應面分析并建立了顯著影響多糖提取率的二次回歸模型，并利用統計學方法對模型進行顯著性檢驗，優化各自變量水平，探討各自變量間交互作用。試驗結果表明CCD-RSM實驗所得擬合方程可較好地描述多糖提取率與各自變量之間的關系，所建立的數學模型具有良好的預測性，所選工藝條件重復性好，參數真實可靠，且具有實際意義。超聲提取應用規模較小，存在消除噪聲方面的問題及提取機理尚不明確。《中華人民共和國藥典》中金櫻子多糖的水浴回流法提取工藝步驟繁瑣，耗時長，而本文應用超聲提取快速有效，科學合理，為金櫻子多糖提取工藝的研究提供新方法，具有實際的指導意義和良好的應用前景，為《中華人民共和國藥典》質量標準的修訂提供一定的理論依據。

采用CCD-RSM對貴州產金櫻子多糖的超聲提取工藝進行優化研究，得到和實驗結果擬和程度較高的數學模型和較優的貴州產金櫻子多糖提取工藝條件。最終結論為：料液比1：30、超聲時間為60 min、超聲溫度75 ℃，實際上金櫻子多糖提取率為37.54%，該工藝簡便快速可行。

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Optimization of Ultrasonic Extraction for Polysaccharide from Rosa Laevigatae Michx in Guizhou by Central Composite Design-Response Surface Methodology

YAN Jianxin1,2，WANG Xiaoli1

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004,China；2.DepartmentofPharmacy，GuizhouProvinicalPeople'sHospital，Guiyang550001,China)

Objective To select the optimum ultrasonic extracting method of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx inGuizhou. Methods Independent variables were solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature, dependent variable was extraction rate ratio of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx.Linear or nonlinear mathematic models were used to estimate the relationship between independent and dependent variables.Response surface methodology was used to optimize the process of extraction.Prediction was carried out through comparing the observed and predicted value. Results The optimum extraction condition for the polysaccharides was as follows: extracting at 75 ℃ for 60 min and ratio of liquid to solid 30：1 ( mL：g).The average extraction yield of polysaccharides was 37.54% under the optimum extraction condition. Conclusion This optimized extraction process is simple and reliable for the extraction of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx inGuizhou.

RosaLaevigataeMichx inGuizhou；Polysaccharides；Ultrasonic extraction；Central composite design-response surface methodology

2014-11-17

2015-02-27

*貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項項目(黔科合ZY字[2012]3004號)

晏建新(1972-)，女，湖南隆回人，主管藥師，碩士，研究方向：中草藥開發與應用。電話：(0)15761600430，E-mail：850144305@qq.com 。

王曉麗(1956-)，女，貴州貴陽人，教授，學士，研究方向：中草藥開發與應用。電話：(0)18984391719，E-mail： 346195348@qq.com。

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2015)10-1367-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.028