酒石酸氫可酮片的人體藥代動力學研究

郝光濤，曲恒燕，張麗娟，李媛媛，高洪志，董瑞華，王曉芳，梁宇光，張媛媛，劉澤源，張　宏（.軍事醫學科學院附屬醫院臨床藥理研究室，北京 0007；.安徽醫科大學，安徽 合肥 3003）

·實驗研究·

酒石酸氫可酮片的人體藥代動力學研究

郝光濤1，曲恒燕1，張麗娟1，李媛媛1，高洪志1，董瑞華1，王曉芳1，梁宇光1，張媛媛2，劉澤源1，張宏1（1.軍事醫學科學院附屬醫院臨床藥理研究室，北京 100071；2.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032）

目的：研究酒石酸氫可酮片的人體藥代動力學。方法：本研究采用單次給藥、平行設計試驗方法，按照給藥劑量5、10、15 mg（低、中、高）分為三組，每組10人。通過高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法測定血漿中氫可酮及其兩種代謝產物（去甲基氫可酮和氫嗎啡酮）的濃度。采用WinNonlin 6.1分析軟件計算藥代動力學參數。結果：氫可酮、去甲基氫可酮的線性范圍均為0.05 ～ 50.00 μg·L-1，氫嗎啡酮的線性范圍為0.01 ～ 10.00 μg·L-1；受試者口服酒石酸氫可酮片后體內氫可酮、去甲基氫可酮的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞隨劑量增加而增加與給藥劑量呈良好線性關系。研究過程中無嚴重不良事件發生。結論：HPLC-MS/MS測定法靈敏、準確、簡便，適用于血漿中氫可酮及其代謝產物濃度的測定以及人體藥代動力學研究。

酒石酸氫可酮；藥代動力學；高效液相色譜串聯質譜；血藥濃度

氫可酮（hydrocodone，HC）是一種常見、半合成的阿片類麻醉性鎮咳、鎮痛藥，主要作用于中樞神經系統和平滑肌，適用于咳嗽以及重度疼痛的治療。

目前已報道幾種檢測血漿或者血液中氫可酮或氫嗎啡酮的方法[1]，主要采用高效液相色譜法或液相色譜串聯質譜法[2]，氣相色譜-質譜法[3]，然而，尚未有同時檢測氫可酮、去甲基氫可酮及氫嗎啡酮方法的建立。此外，酒石酸氫可酮片在中國非癌性疼痛患者體內藥代動力學的研究較少。本文在參考文獻[4]的基礎上，建立了同時檢測氫可酮及其代謝產物去甲基氫可酮和氫嗎啡酮的HPLC-MS/MS法，研究酒石酸氫可酮在中國非癌性疼痛患者體內的藥代動力學過程，為臨床合理應用本品提供參考。

1　材料

1.1儀器

1200高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（美國Agilent公司）：高效液相色譜系統包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱；串聯質譜儀為API 3000型三重四極桿串聯質譜儀，含電噴霧離子化源以及串聯三重四極桿質譜檢測器。色譜工作站：Analyst 1.4.2 數據處理軟件（美國AB公司）。GL-88B漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AB104電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；3-18K型高速低溫離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q Plus 純水器（美國密理博中國有限公司）；Empore MPC-SD 固相萃取盤（美國LabTech有限公司）。

1.2藥品與試劑

酒石酸氫可酮片（青海制藥廠有限公司，批號20100454）；氫可酮（含量：99%，青海制藥廠有限公司，批號02-01682，）；鹽酸去甲基氫可酮（含量：1.000±0.003 mg·mL-1，青海制藥廠有限公司，批號FE010908-01）；氫嗎啡酮（含量：1.000±0.006 mg·mL-1，青海制藥廠有限公司，批號FE080509-02）；氫可酮-D3（含量：101.2±0.8 μg·mL-1，青海制藥廠有限公司，批號FE060208-01）；去甲基氫可酮-D3（含量：99.6±0.8 μg·mL-1，青海制藥廠有限公司，批號FE082708-02）；氫嗎啡酮-D3（含量：96.9±0.7 μg·mL-1，青海制藥廠有限公司，批號FE092507-01）；甲酸、乙腈、二氯甲烷、異丙醇、三氟乙酸、氨水、甲酸銨均為色譜純，均由DIMA公司提供；試驗用水為去離子水，本實驗室自制；其它試劑為AR試劑。

2　方法

2.1研究對象

30例非癌性疼痛受試者（男性15名，女性15名）參加本試驗，年齡（36.2 ± 4.15）歲，身高（166 ± 5） cm，體質量（61.2 ± 6.81） kg，BMI（21.94 ± 1.21） kg·m-2。在給藥前的第7天至給藥前第1天對受試者進行檢查來決定是否符合入選標準，符合入選標準的受試者，入住軍事醫學科學院附屬醫院臨床藥理學研究室Ⅰ期實驗病房，整個實驗過程由醫生及護士監護。本實驗的方案、知情同意書及其它相關實驗文件都已遞交軍事醫學科學院附屬醫院藥物臨床試驗倫理委員會備案，并獲得該倫理委員會的批準（審批號：2010-1-10，備案號：2011-03-34）。下列檢測在受試者簽署書面知情同意書之后進行。

檢查項目包括：入選/排除標準、體格檢查、生命體征（血壓、脈搏、體溫、呼吸頻率）、心電圖、實驗室檢查（血常規、血生化、尿常規）、尿妊娠檢查（女性受試者）、酒精呼吸檢查、煙檢、尿液藥物篩查，無精神病及遺傳病史，如果懷疑有食物或其它影響因素影響了篩選期的化驗結果，可以在除去影響因素的情況下重新檢查，要求記錄重復檢查的結果和原因。

2.2給藥方案及血樣采集

本研究采用單次給藥設計，共計30例受試者[5-6]，每10例受試者分為一組，共3組，采用平行試驗方法進行試驗。

試驗前后24 h內不得飲酒及咖啡類飲品。給藥當日受試者空腹，由研究者和護士按試驗設計給予受試者相應劑量的藥物（5、10、15 mg），并做記錄。給藥完成后在“試驗藥品使用登記表”上記錄給藥劑量及給藥時間并由受試者簽字，最后由研究者和臨床醫生共同簽字確認。受試者用200 mL的溫開水送服藥物。

分別于給藥前及給藥后15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h，采集上肢靜脈血5 mL，肝素抗凝血樣，靜置0.5 h左右，3000 r·min-1離心10 min ，分離上層血漿，置于– 40 ℃冰箱保存待測。

實驗結束出院前（給藥后36 h），對受試者進行相關檢查，包括體格檢查、生命體征（血壓、脈搏、體溫、呼吸頻率）、心電圖、實驗室檢查（血常規、血生化、尿常規），并記錄在此期間的合并用藥及不良事件。如有檢查項目異常且有臨床意義，應追蹤隨訪至檢查項目恢復正常或可接受的穩定范圍。以實驗前后各項實驗室檢查和實驗期間的生命體征為指標進行安全性評價[7]。

2.3血漿樣品的處理與測定

精密量取200 μL血漿樣品置1.5 mL離心管中，加100 μL內標工作溶液，及300 μL 0.1%三氟乙酸溶液，渦旋混合，待做固相萃取。

SPE：（1）活化：依次用400 μL洗脫液（含2%氨水的二氯甲烷-異丙醇混合溶液（80∶20）、400 μL甲醇、400 μL三氟乙酸溶液（0.1%甲酸）進行柱活化；（2）上樣：取待上樣樣品600 μL至SPE小柱上；（3）淋洗：依次用400 μL水、400 μL 0.1%三氟乙酸溶液、400 μL乙腈、400 μL二氯甲烷-異丙醇混合溶液（80 : 20）淋洗；（4）洗脫：用400 μL洗脫液分2次連續洗脫。

收集洗脫液800 μL，通氮氣流40 ℃蒸發至干燥。

用200 μL的流動相溶液（A∶B = 90∶10）復溶，渦旋15 s，取50 μL進樣，進行HPLC-MS/MS分析。

2.4色譜和質譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 SIL-Dimensions柱 （2.1 mm×100 mm，5.0 μm，Thermo Hypersil-Keystone，USA）；流動相A：含20 mmol甲酸銨的0.2%甲酸溶液，流動相B：0.1%甲酸的乙腈溶液；流速：0.75 mL·min-1；柱溫：20 ℃；進樣量：50 μL。梯度洗脫，分別在0、0.3、1、3.6、3.7、6.5 min將流動相A/B（v/v）調整為（5 : 95）、（5 : 95）、（12 : 88）、（12 : 88）、（5 : 95）、（5 : 95）。

離子源：電噴霧離子化源（ESI源）；離子極性：正離子（positive）；離子檢測方式：多反應監測（MRM）方式；噴射電壓：2000 V；離子源溫度：540 ℃；源內氣體1（GS1，N2）壓力：7 psi；源內氣體2（GS2，N2）壓力：12 psi；氣簾氣體（N2）壓力：6 psi；碰撞氣（CAD，N2）壓力：6 psi；CE電壓：氫可酮38 V，去甲基氫可酮40 V，氫嗎啡酮39 V；DP電壓（解簇電壓）：35 V。

2.5數據分析

采用WinNonlin 6.1藥代動力學分析軟件標準，非房室模型方法根據所測的受試者血藥濃度時間數據計算藥代動力學參數，對各劑量組Cmax和AUC與給藥劑量進行線性回歸分析。

3　結果

3.1氫可酮、去甲基氫可酮和氫嗎啡酮的色譜行為及專一性

氫可酮、氫嗎啡酮、去甲基氫可酮和內標氫可酮-D3、氫嗎啡酮-D3、去甲基氫可酮-D3的保留時間以及Q1、Q3選擇離子詳見表1，典型的MRM色譜圖見圖1 ～ 3。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾氫可酮、氫嗎啡酮、去甲基氫可酮和內標氫可酮-D3、氫嗎啡酮-D3、去甲基氫可酮-D3的測定。

表1　分析物和內標的保留時間及質譜m/z選擇Tab 1　The retention time of analyte and internal standard and the selection ofm/z

3.2血漿樣品標準曲線

取6名受試者的空白血漿（由軍事醫學科學院附屬醫院提供）混合，分別精密加入標準系列溶液的混合對照品溶液，渦旋混勻，配成含氫可酮、去甲基氫可酮的濃度各分別為0.05、0.10、0.20、0.50、2.00、5.00、20.00、50.00 μg·L-1的標準含藥血漿，氫嗎啡酮的濃度各分別為0.01、0.02、0.04、0.10、0.40、1.00、4.00、10.00 μg·L-1的標準含藥血漿，按上述血漿樣品處理方法進行測定。以血漿中待測物濃度（X）為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權（權重系數w = 1/x2）最小二乘法進行回歸運算，求得回歸方程：氫可酮：Y = 0.377 X + 2.15×10-4，r = 0.998 7，定量下限為0.05 μg·L-1；去甲基氫可酮：Y = 0.384 X + 3.21×10-4，r = 0.999 2，定量下限為0.05 μg·L-1；氫嗎啡酮：Y = 0.467 X + 7.25×10-4，r = 0.999 4，定量下限為0.01 μg·L-1。

圖1　血漿中氫可酮和內標氫可酮-D3的典型MRM色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿中加入氫可酮（2 μg·L-1）和內標氫可酮-D3（2 μg·L-1），C – 1號受試者口服5 mg酒石酸氫可酮片0.75 h后血漿藥物濃度；1 – 氫可酮，2 – 內標氫可酮-D3Fig 1　Typical MRM chromatograms of hydrocodone and D3-hydrocodone (IS) in plasmaA – blank plasma, B – blank plasma adding hydrocodone (2 μg·L-1) and D3-hydrocodone (IS) (2 μg·L-1), C – oral dose of hydrocodone tartrate 5 mg after 0.75 h in subject No.1; 1 – hydrocodone, 2 – D3-hydrocodone

圖2　血漿中去甲基氫可酮和內標去甲基氫可酮-D3的典型MRM色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿中加入去甲基氫可酮（2 μg·L-1）和內標去甲基氫可酮-D3（2 μg·L-1），C – 1號受試者口服5 mg酒石酸氫可酮片0.75 h后血漿藥物濃度；1 – 去甲基氫可酮，2 – 內標去甲基氫可酮-D3Fig 2　Typical MRM chromatograms of demethylation of hydrocodone and D3-demethylation of hydrocodone (IS) in plasmaA – blank plasma, B – blank plasma adding demethylation of hydrocodone (2 μg·L-1) and D3-demethylation of hydrocodone (IS) (2 μg·L-1), C – oral dose of hydrocodone tartrate 5 mg after 0.75 h in subject No.1; 1 – demethylation of hydrocodone, 2 – D3- demethylation of hydrocodone

圖3　血漿中氫嗎啡酮和內標氫嗎啡酮-D3的典型MRM色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿中加入氫嗎啡酮（2 μg·L-1）和內標氫嗎啡酮-D3（2 μg·L-1），C – 1號受試者口服5 mg酒石酸氫可酮片0.75 h后血漿藥物濃度；1 – 氫嗎啡酮，2 – 內標氫嗎啡酮-D3Fig 3　Typical MRM chromatograms of hydromorphone and D3-hydromorphone (IS) in plasmaA – blank plasma, B – blank plasma adding hydromorphone (2 μg·L-1) and D3-hydromorphone (IS) (2 μg·L-1), C – oral dose of hydrocodone tartrate 5 mg after 0.75 h in subject No.1; 1 – hydromorphone, 2 – D3-hydromorphone

3.3方法學考察

制備含氫可酮、去甲基氫可酮分別為0.125、3.000、40.000 μg·L-1的標準含藥血漿，氫嗎啡酮為0.025、0.600、8.000 μg·L-1的標準含藥血漿（每個濃度做6份樣品）及一條隨行標準曲線，按上述處理血漿的方法操作。每天做一批及一條隨行標準曲線，連續做3 d，共3批，每批每個濃度做6份樣品，計算回收率、批內和批間精密度，結果見表2。

表2　 HPLC-MS/MS法測定血漿中氫可酮、去甲基氫可酮和氫嗎啡酮的精密度和回收率.n= 18Tab 2　Accuracy and recovery of hydrocodone, hydromorphone and demethylation of hydrocodone in plasma with HPLC-MS/MS.n= 18

3.4血藥濃度測定結果和主要藥代動力學參數

受試者單次口服酒石酸氫可酮片5、10、15 mg后氫可酮平均血藥濃度-時間曲線見圖4；酒石酸氫可酮的代謝產物去甲基氫可酮、氫嗎啡酮的平均血藥濃度-時間曲線見圖5和圖6。

圖4　受試者單次口服酒石酸氫可酮片5、10、15 mg后氫可酮平均血藥濃度-時間曲線.n= 10Fig 4　Mean plasma concentration-time curve of hydrocodone in subjects after the oral dose of 5, 10, 15 mg of hydrocodone tartrate.n= 10

圖5　受試者單次口服酒石酸氫可酮片5、10、15 mg后去甲基氫可酮平均血藥濃度-時間曲線.n= 10Fig 5　Mean plasma concentration-time curve of demethylation hydrocodone in subjects after the oral dose of 5, 10, 15 mg of hydrocodone tartrate.n= 10

圖6　受試者單次口服酒石酸氫可酮片5、10、15 mg后氫嗎啡酮平均血藥濃度-時間曲線.n= 10Fig 6　Mean plasma concentration-time curve of hydromorphone in subjects after the oral dose of 5, 10, 15 mg of hydrocodone tartrate.n= 10

采用WinNonlin 6.1藥代動力學分析軟件標準非房室模型方法根據血藥濃度數據計算每個受試者的藥代動力學參數，受試者給予不同劑量酒石酸氫可酮后，氫可酮、去甲基氫可酮、氫嗎啡酮的平均藥代動力學參數見表3。

表3　受試者單次口服各劑量酒石酸氫可酮片后氫可酮、去甲基氫可酮和氫嗎啡酮的平均藥代動力學參數Tab 3　Main pharmacokinetic parameters of hydrocodone, demethylation of hydrocodone and hydromorphone in subjects after the oral dose of hydrocodone tartrate

從主要藥代動力學參數可以看出，氫可酮的Cmax、AUC0-t隨劑量增加而增加，將氫可酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞平均值分別與劑量進行線性回歸，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞與給藥劑量的相關系數分別為0.983 0、0.984 9和0.985 1。去甲基氫可酮的Cmax、AUC0-t隨劑量增加而增加，將去甲基氫可酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞平均值分別與劑量進行線性回歸，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞與給藥劑量的相關系數分別為1、0.981 5和0.981 2。氫嗎啡酮的Cmax、AUC0-t隨劑量增加而增加，將氫嗎啡酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞平均值分別與劑量進行線性回歸，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞與給藥劑量的相關系數分別為0.991 9、0.991 0和0.984 2。

3.5不良事件

本研究過程中，對中國非癌性疼痛的患者單次經口服給予5、10和15 mg酒石酸氫可酮片，共入選了30例受試者，男女各半。共有15例受試者發生不良事件22例次，主要表現為嗜睡5例次（22.73%）、頭暈9例次（40.91%）、惡心4例次（18.18%）、嘔吐2例次（9.09%）、乏力1例次（4.55%）、胸悶1例次（4.55%）；其中與試驗藥物可能相關的不良事件16例次（72.73%），很可能相關的6例次（27.28%）；嚴重程度為：輕度22例次（100%）；沒有對受試者采取對癥處置。無受試者因不良事件而退出試驗。

4　討論

Valtier等[8]通過HPLC-MS/MS法測定血漿中氫可酮、氫嗎啡酮和未經酶代謝的氫可酮的濃度，相比于該方法，本實驗建立的HPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中氫可酮及其代謝產物去甲基氫可酮和氫嗎啡酮的濃度，靈敏度高，結果可靠，樣品分析時間短（僅需6.5 min），定量下限最低達到0.01 μg·L-1。固相萃取的血漿樣品前處理法可同時完成樣品富集與凈化，大大提高了檢測靈敏度，該法比液液萃取更快，更節省溶劑，具有重現性好的優點。本法經方法學考察得出的批內、批間精密度和回收率均符合人體藥代動力學要求。

從本研究所得的主要藥代動力學參數可以看出，對于中國非癌性疼痛的患者單次經口服給予5、10和15 mg酒石酸氫可酮片，氫可酮、去甲基氫可酮、氫嗎啡酮的平均Cmax和AUC0-t隨劑量增加而增加，呈良好線性關系。代謝產物去甲基氫可酮和氫可酮的半衰期相似，氫嗎啡酮的半衰期較長。代謝產物的血漿半衰期均較母體的半衰期長。同時，各劑量組氫可酮、去甲基氫可酮、氫嗎啡酮的平均Cmax和AUC0-t的標準差較大，說明此類藥物及其代謝產物的藥代動力學過程存在較大的個體差異。

單次使用酒石酸氫可酮片治療的受試者所發生的常見不良事件與使用阿片類藥物后所報告的常見不良事件相吻合。無受試者因不良事件退出試驗。研究過程中無嚴重不良事件發生。結果表明對中國非癌性疼痛的患者單次經口服給予5、10和15 mg酒石酸氫可酮片，安全性良好。據報道[7]，美國食品藥品監督管理局（FDA）于2013年10月批準重酒石酸氫可酮緩釋膠囊上市，該藥可為疼痛治療提供新的處方選擇。

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Pharmacokinetics of hydrocodone tartrate tablets in human

HAO Guang-tao1, QU Heng-yan1, ZHANG Li-juan1, LI Yuan-yuan1, GAO Hong-zhi1, DONG Rui-hua1, WANG Xiao-fang1, LIANG Yu-guang1, ZHANG Yuan-yuan2, LIU Ze-yuan1, ZHANG Hong1(1. Department of Clinical Pharmacology, Affiliated Hospital, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China; 2. Anhui Medical University, Hefei 230032, China)

Objective:To study the pharmacokinetics of hydrocodone tartrate tablets in human.Methods:We carried out single dose, parallel design study. Subjects were divided into three groups according to the dose of 5 mg, 10 mg, 15 mg (low, medium, high), and each group contained ten subjects. HPLC-MS/MS method was used for analysis of hydrocodone and its two metabolites (demethylation of hydrocodone and hydromorphone). WinNonlin 6.1 software was used to calculate the pharmacokinetic parameters.Results:Linearity was established in the range of 0.05 – 50.00 μg·L-1for hydrocodone and demethylation of hydrocodone, and 0.01 –10.00 μg·L-1for hydromorphone. After the oral dose of hydrocodone tartrate tablets, Cmax, AUC0-tand AUC0-∞increased with the dose and showed a good linear relationship. There were no serious adverse events during the course of this study.Conclusion:HPLCMS/MS is a sensitive and accurate method, which is suitable for the analysis of hydrocodone and its two metabolites (demethylation of hydrocodone and hydromorphone) in plasma and the pharmacokinetics study of hydrocodone tartrate tablets in human.

Hydrocodone tartrate; Pharmacokinetics; HPLC-MS/MS; Blood drug concentration

R969.1

A

1672 – 8157(2015)02 – 0076 – 06

張宏，男，副研究員，研究方向：生物醫藥工程。E-mail：13601192278@126.com

郝光濤，男，主管藥師，主要從事人體藥代動力學研究。E-mail：power822@126.com

（2014-05-16

2014-12-21）