復方鹿角霜片的質量控制*

張雨薇，王燕燕，王亞芬，張凱林

(1.三峽大學第一臨床醫學院、宜昌市中心人民醫院，宜昌 443003；2.湖北華龍生物制藥有限公司，孝感 430028)

復方鹿角霜片的質量控制*

張雨薇1，王燕燕1，王亞芬2，張凱林2

(1.三峽大學第一臨床醫學院、宜昌市中心人民醫院，宜昌 443003；2.湖北華龍生物制藥有限公司，孝感 430028)

目的建立復方鹿角霜片的質量控制方法。方法采用薄層色譜法對制劑中鹿銜草、忍冬藤進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定忍冬藤中的馬錢苷、當藥苷，鹿銜草中的水晶蘭苷的含量。結果定性鑒別薄層色譜斑點清晰，特征明顯，專屬性強；高效液相色譜法測定含量，專屬性強，在范圍內水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷進樣濃度與色譜峰面積均呈良好的線性關系(r>0.999)，平均回收率分別為97.2%，98.4%，96.0%，RSD分別為1.4%，0.8%，0.8%。結論利用薄層色譜法定性、高效液相色譜法定量，方法簡便準確，重復性好，可有效控制復方鹿角霜片的質量。

鹿角霜片，復方；水晶蘭苷；馬錢苷；當藥苷；色譜法，高效液相；質量控制

復方鹿角霜處方來源于宜昌名老中醫孫庭富祖傳一百余年的經驗方，具有強筋健骨、祛風、除濕，疏利關節，抗炎消腫的功效，被宜昌市中心人民醫院引用于治療類風濕關節炎[1]。該處方由鹿角霜、鹿銜草、忍冬藤、蜂房、桂枝和桑枝6味藥材組成。有報道稱鹿角霜具有抗炎、調節免疫作用[2-3]，鹿銜草提取物能夠抑制一氧化氮的產生進而發揮抗炎作用[4]，忍冬藤水煎液對小鼠卡拉膠性足跖腫脹炎癥模型和二甲苯性耳廓腫脹炎癥模型均具有較好的抗炎作用[5]，蜂房水提液也具有顯著的抗炎鎮痛作用[6-7]。本品用于治療多種類型的類風濕性關節炎療效確切，安全可靠，不良反應少，并且能在一定程度上減少糖皮質激素用量，從而降低用藥毒副反應，減輕患者經濟負擔，提高患者生活質量，用藥前景良好。為有效控制產品質量，筆者在本實驗中對其進行了質量控制研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀(色譜工作站：Chromeleon，進樣器：U3000型自動進樣器；檢測器：DAD 3000型)；BT-25S型電子分析天平(Satorius，感量：0.01 mg)；KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；

1.2 試藥 水晶蘭苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111870-201302)；馬錢苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111640-201005)；當藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111742-200501)；復方鹿角霜片(武漢健民藥業集團股份有限公司，批號：20130601，20130602，20130603，每片0.45 g)；乙腈為色譜純；水為雙蒸水；其他試劑皆為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 忍冬藤的薄層層析鑒別 取本品5片，除去包衣，研細，加乙醇20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約3 mL，置已處理好的活性炭-氧化鋁柱上[依次加入活性炭0.5 g及中性氧化鋁2 g，內徑10～20 mm]，用乙醇30 mL洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取馬錢苷對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另取忍冬藤對照藥材2 g，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為對照藥材溶液。再按處方比例稱取除忍冬藤外的其余5味藥材，同法制得陰性樣品溶液，按供試品溶液的制備進行提取，即得[8]。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取對照品溶液及對照藥材溶液各5 μL、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-水(12：3：5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖1。

1.馬錢苷；2.忍冬藤對照藥材；3.復方鹿角霜片；4.陰性對照

圖1 忍冬藤的薄層色譜鑒別[溫度：(15±2) ℃；相對濕度：(70±5)%]

1.loganin；2.reference of lonicerae japonicae caulis；3.compound cornu cervi degelatinatum tablets；4.negative control

Fig.1 Qualitative identification of lonicerae japonicae caulis by TLC[temperature：(15±2) ℃；relative humidity：(70±5)%]

2.1.2 鹿銜草的薄層層析鑒別 取本品5片，除去包衣，研細，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液。取鹿銜草對照藥材1 g，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，取上清液作為對照藥材溶液。另按處方比例稱取除鹿銜草外的其余五味藥材，同法制得陰性樣品溶液[9]。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取對照藥材溶液5 μL、3批供試品溶液(批號：20130601，20130602，20130603)及陰性樣品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5：4：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相同位置上，顯相同顏色的主斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

1.鹿銜草對照藥材；2～4.3批復方鹿角霜片；5.陰性對照

圖2 鹿銜草的薄層色譜鑒別[溫度：(15±2) ℃；相對濕度：(70±5)%]

1.reference of pyrola herba；2-4.three batches of compound cornu cervi degelatinatum tablets；5.negative control

Fig.2 Qualitative identification of pyrola herba by TLC [temperature：(15±2) ℃；relative humidity：(70±5)%]

2.1.3 忍冬藤和鹿銜草的高效液相色譜法鑒別 在”2.2.5”項下含量測定專屬性實驗項下的供試品液相色譜圖中，供試品應顯示與水晶蘭苷、馬錢苷和當藥苷對照品保留時間一致的色譜峰，見圖3。

2.2 復方鹿角霜片含量測定

2.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以0.4%磷酸溶液-乙腈為流動相，按表1進行線性梯度洗脫。柱溫27 ℃，檢測波長236 nm，流速1.0 mL·min-1[10]。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷對照品各10 mg，精密加水定容至50 mL至溶解，制成每毫升中含水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷各200 μg的溶液，作為對照品儲備液。分別精密量取儲備液適量，加水定量稀釋成每毫升含水晶蘭苷40 μg、

A.缺忍冬藤陰性樣品溶液；B.缺鹿銜草陰性樣品溶液；C.混合對照品溶液；D.供試品溶液；1.水晶蘭苷；2.馬錢苷；3.當藥苷

圖3 復方鹿角霜片專屬性實驗色譜圖

A.negative control without lack of lonicerae japonicae caulis；B.negative control without pyrolae herba；C.mixed control solution；D.samples；1.monotropein；2.loganin；3.chiratin

Fig.3 Chromatograms of specificity test on compoundcornucervidegelatinatumtablets

馬錢苷40 μg及當藥苷40 μg的溶液，作為混合對照品溶液。

表1 含量測定流動相條件

Tab.1 Mobile phase of content determination %

時間/min0．4%磷酸溶液乙腈0982～11982～1298→862→14～408614～5086→9814→2

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，研細，取約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，續濾液作為供試品溶液[11-12]。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例分別制備不含忍冬藤和鹿銜草的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法同法制備忍冬藤陰性樣品溶液以及鹿銜草陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性實驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示陰性樣品溶液色譜圖中在與混合對照品溶液色譜峰相應的位置上無色譜峰出現，陰性無干擾，見圖3。

2.2.6 線性關系考察 取“2.2.2”項下的水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷對照品儲備液，分別精密量取對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0 mL置1～7號10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取10 μL依次注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。由溶液濃度(X)對色譜峰面積(Y)進行線性回歸，結果見表2。

表2 3種成分的回歸方程 Tab.2 Regression equation of three constituents

2.2.7 精密度實驗 精密稱取供試品溶液(復方鹿角霜片，批號：20130601)，重復進樣6次，水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷色譜峰面積的RSD%分別為0.6%，0.6%，0.7%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性實驗 精密稱取供試品溶液(復方鹿角霜片，批號：20130601)，室溫放置，分別于0，1，2，4，8，12，16，24 h時，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，計算RSD。水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷峰面積的RSD分別為0.8%，0.7%，0.9%，說明待測液在24 h內穩定。

2.2.9 加樣回收率實驗 取已知含量的供試品(批號：20130601，水晶蘭苷含量：1.213 mg·g-1，馬錢苷含量3.087 mg·g-1，當藥苷含量1.547 mg·g-1) 6份，每份約1.0g，精密稱定，置100 mL量瓶中，分別精密加入水晶蘭苷0.373 6 mg·mL-1、馬錢苷0.425 2 mg·mL-1及當藥苷0.401 2 mg·mL-1的對照品溶液各5 mL，照供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，結果見表3。

2.2.10 重復性實驗 取同一批樣品(批號：20130601)6份，照“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法進行配制，進行液相分析，計算得水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷含量的RSD分別為1.3%，1.2%，1.1%。結果表明重復性良好。

2.2.11 供試品含量測定 分別稱取3個不同批次的復方鹿角霜片樣品各1.0 g，依法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定供試品溶液中水晶蘭苷、馬錢苷、當藥苷含量，結果見表4。

3 討論

鹿角霜《中華人民共和國藥典》2010年版收載中僅用外觀性狀來進行鑒別，無特異性方法。鑒于鹿角霜與鹿茸等鹿制品均含多種氨基酸，參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部鹿茸項下的鑒別方法對鹿角霜進行了理化及薄層色譜鑒別方法預試，結果表明供試液中蜂房提取物對測定有干擾，不適用于本品中鹿角霜的鑒別，但將理化鑒別、薄層鑒別訂入鹿角霜藥材質量標準，以達到控制成品的質量。經查閱文獻，桂枝的鑒別方法大多采用桂皮醛等揮發油，但由于本品采用水提醇沉工藝，桂皮醛等成份的提取率較低，不適用于本品中桂枝的鑒別，故未采用。桑枝《中華人民共和國藥典》收載中僅采用顯微方法進行鑒別。由于本處方中桑枝非原藥材粉入藥，是采用水煮醇沉工藝制得，故顯微鑒別方法不可行。參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部桑白皮項下薄層鑒別方法，對本品中桑枝鑒別進行了方法學研究，結果顯示陰性對照有干擾，不適合本品中桑枝的鑒別。

經方法學研究表明：鹿銜草及忍冬藤薄層鑒別方法展開效果良好，專屬性強，最終將鹿銜草、忍冬藤鑒別訂入了質量標準中。

由于中藥處方的成分復雜且含量微小，一般的方法難以對復雜的中藥處方進行分離和檢測[13]。筆者在本實驗中選用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法同時測定復方鹿角霜片中水晶蘭苷、馬錢苷以及當藥苷3種有效成分，方法靈敏，簡便，可操作性強。建立方法的同時進一步對流速、柱溫、流動相比例、測定波長等因素進行了篩選。根據二極管陣列檢測器采集得到的在190～400 nm波長范圍內結果，最終選擇236 nm作為檢測波長，與《中華人民共和國藥典》2010年版一部鹿銜草中水晶蘭苷，忍冬藤中馬錢苷含量測定檢測波長基本一致。

通過本研究建立的復方鹿角霜片薄層色譜定性鑒別，以及高效液相色譜定量測定的方法，簡便、準確，重復性好，可有效控制產品質量。

表3 3種成分加樣回收率實驗結果 Tab.3 Results of recovery tests on three constituents

表4 3批復方鹿角霜片每片含量測定結果

Tab.4 Results of content determination on each tablets of three batches of compoundcornucervidegelatinatumtablets

mg

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《醫藥導報》編輯部

Quality Control of Compound Cornu Cervi Degelatinatum Tablets

ZHANG Yuwei1, WANG Yanyan1, WANG Yafen2, ZHANG Kailin2

(1.TheFirstCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity&YichangCentralPeople`sHospital,Yichang443003,China； 2.HubeiHualongBiopharmaceuticalLimitedCompany,Xiaogan430028,China)

Objective To establish a method of quality control for compoundCornucervidegelatinatumtablets. Methods Thin layer chromatography (TLC) was used for qualitative identification ofLoniceraeJaponicaeCaulisandPyrolaHerbain the preparations.High performance liquid chromatography was used to determine the content of loganin and chiratin inLoniceraeJaponicaeCaulisand monotropein inPyrolaHerba. Results The TLC spots were clear and specific in the qualitative identification.HPLC determined the content.In the concentration range, monotropein, loganin and chiratin had a good linear relationship with peak area (r>0.999).The mean recovery was 97.2%, 98.4% and 96.0%； RSD was 1.4%, 0.8% and 0.8%. Conclusion The present study employs TLC for quality control and HPLC for quantity control.The methods are simple and accurate, have good reproducibility, and can effectively control the quality of compoundCornucervidegelatinatumtablets.

Cornucervidegelatinatumtablets, compound； Monotropein； Loganin； Chiratin； Chromatography, high performance liquid； Quality control

2015-01-08

2015-03-12

*國家”重大新藥創制”科技重大專項項目(2011ZX09102-006-05)

張雨薇(1990-)，女，黑龍江雞西人，在讀碩士，研究方向：天然藥物化學。電話：(0)13035132949，E-mail：m13035132949@163.com。

王燕燕(1964-)，女，湖北宜昌人，教授，博士研究生，主任藥師，碩士生導師，研究方向：醫院藥學。電話：0717-6487741，E-mail：wangyy1001@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1644-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.024

導報》論文

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