松江鱸(Trachidermus fasciatus)泛素結合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析

陳學昭，張雷，于珊珊，畢彩紅，劉春影，祝茜*

(1.山東大學(威海) 海洋學院，山東 威海 264209)

松江鱸(Trachidermus fasciatus)泛素結合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析

陳學昭1，張雷1，于珊珊1，畢彩紅1，劉春影1，祝茜1*

(1.山東大學(威海) 海洋學院，山東 威海 264209)

泛素結合酶(UbcE2)是蛋白泛素化過程中所必需的酶，在泛素轉移和底物的特異性識別方面發(fā)揮著重要的作用。本實驗利用RACE技術克隆獲得了全長為993 bp的松江鱸泛素結合酶E2-D2基因cDNA序列(命名為TfUbcE2-D2)，其開放閱讀框為444 bp，編碼147個氨基酸。通過SMART預測得知，TfUbcE2-D2含有一個UBCc結構域。同源比對結果表明該基因與其他物種的同源性為92.31%。實時熒光定量PCR顯示，TfUbcE2-D2廣泛表達于松江鱸各組織，在腎臟中的相對表達量最高，其次為鰓。鰻弧菌(Vibrioanguillarum)刺激后，TfUbcE2-D2在血液、脾臟、肝臟和鰓中表達均上調，其中，脾臟和鰓中的表達量上調約40倍。由以上實驗結果推測，TfUbcE2-D2可能參與松江鱸的先天免疫防御。

泛素結合酶；松江鱸；基因克??；非特異性免疫

1 引言

松江鱸(Trachidermusfasciatus)隸屬于鲉形目，杜父魚科，松江鱸魚屬 ，曾廣泛分布于我國沿海，但由于環(huán)境的破壞及人為因素干擾，其種群數量銳減，于1988年被列為國家二級保護動物。為恢復其種群數量，除對其棲息地的保護外還需要進行人工養(yǎng)殖，而在人工養(yǎng)殖中的各種刺激勢必會引起各種疾病的出現和蔓延。為此，本實驗室著手研究松江鱸的免疫學機制，以期為松江鱸的養(yǎng)殖及保護提供一定的參考依據。

泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome pathway，UPP )，發(fā)現于20世紀70年代末，是介導機體蛋白降解的一個重要機制[1]。通過降解和修飾蛋白，UPP參與生物體多種生理生化過程，表現出功能的多樣性[2—3]。最新研究表明，UPP還參與無脊椎動物免疫反應的調節(jié)和炎癥反應的誘導[4]。組成UPP途徑的成分主要有：泛素(Ubiquitin，Ub) 、泛素活化酶(Ub-Activating enzyme，E1)、泛素結合酶(Ub-Conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(Ub-Ligating enzyme，E3)、26S蛋白酶體(26S Proteasomes)和去泛素化酶(DUBs)。

泛素結合酶E2(UbcE2)通過硫酯鍵與活化的泛素相連，在E3的作用下，泛素與靶蛋白形成泛素-蛋白復合體，UbcE2也可以直接把泛素轉移到靶蛋白的賴氨酸殘基上。所有的UbcE2都含有一個保守的、大約包含150個氨基酸的核心結構域(Ubcc)。目前發(fā)現的E2有50余種，推測其多樣性與對靶細胞的特異性選擇有關[5]。 盡管有研究表明UPP參與了無脊椎動物的先天免疫，但是否參與脊椎動物的先天免疫，目前未見報道。 本文以松江鱸為研究對象，通過基因克隆成功獲得了松江鱸泛素結合酶E2的亞型D2(命名為TfUbcE2-D2)的cDNA全長，進一步采用熒光實時定量PCR手段，分析TfUbcE2-D2 mRNA的組織分布以及鰻弧菌(Vibrioanguillarum)刺激后其表達模式變化，探討泛素結合酶E2在松江鱸先天免疫中的作用，為進一步研究泛素結合酶在魚類免疫方面的作用打下了一定的基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗動物

松江鱸(體質量15～23 g，9～10月齡)取自山東文登埠口松江鱸自然保護區(qū)，實驗前將其飼養(yǎng)于12 ～14℃循環(huán)海水中，適應一周后，挑取正常健康的個體進行試驗。

2.1.2 主要儀器和試劑

7300實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)；RNA提取試劑盒(EZNATMTotal RNA Kit Ⅱ)產自美國Omega公司；逆轉錄酶(Reverse TranscriptaseM-MLV)、RNA酶抑制劑、SYBR○RPremix Ex TaqTM試劑盒為TaKaRa Biotechnology產品(日本)。

2.2 實驗方法

2.2.1 總RNA提取和cDNA合成

(1)實驗處理

將適應后健康的松江鱸分成實驗組和對照組(各50條)：① 對照組：腹腔注射50 μL PBS緩沖液。② 鰻弧菌刺激組：腹腔注射鰻弧菌0.1 mL(約108/mL)。兩組均于刺激后2 h、6 h、12 h、24 h用三卡因甲基磺酸鹽(Sigma，St. Louis，MO，USA)麻醉取樣(每個時間點每組取5尾)，取出的各組織器官(血液、心臟、肝臟、鰓、胃、腸、皮膚、腎臟、脾臟和腦)于液氮中速凍，然后分裝放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)總RNA提取及cDNA合成

根據EZNATMMicroElute○Rtotal RNA Kit Ⅱ試劑盒(QMEGA，USA)的操作說明，提取各個樣品的總mRNA。cDNA合成參照CLONTECH公司SMART(Switching mechanism at 5′ end of RNA template)的指導說明。PCR所用引物為Smart F、Oligo-anchor R，引物序列見表1。

2.2.2 TfUbcE2-D2 cDNA全長克隆

由NCBI GenBank數據庫中查找已發(fā)表的如下魚類U bcE2-D2的cDNA基因序列：羅非魚(XM_003447621.2Oreochromisniloticus)、斑馬宮麗魚(XM_004552029.1Maylandiazebra)、半滑舌鰨(XM_008327233.1Cynoglossussemilaevis)、青鳉(XM_004085735.1Oryziaslatipes)、紅鰭東方鲀(XM_003978490.1Takifugurubripes)、劍魚(XM_005811259.1Xiphophorusmaculatus)、斑馬魚(NM_199952.1Daniorerio)、大西洋鮭(BT056835.1Salmosalar)、胡瓜魚(BT074727.1Osmerusmordax)和藍鯰魚(GU588028.1Ictalurusfurcatus)，用DNAman進行多序列比對，并用Primer Premier 5.0在保守序列區(qū)設計簡并引物(TfR1、TfF1，見表1)。以松江鱸肝臟cDNA為模板進行PCR，反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性50 s，55℃復性45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)后，72℃總延伸10 min。將純化產物進行克隆測序獲得中間片段。根據獲得序列設計特異性引物TfF2、TfR2分別與3′ anchor R、 5′ primer 配對進行RACE克隆，得到5′端和3′端序列。利用Clustal W、DNAman、BioEdit等生物分析軟件并結合人工校對，對TfUbcE2-D2的5端、中間序列和3′端進行拼接，得到目的基因cDNA全長序列。

2.2.3 TfUbcE2-D2基因序列分析

通過Expasy (http://www.au.expasy.org/) 對TfUbcE2-D2的cDNA序列進行蛋白翻譯、分子量及等電點預測，通過SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白的結構域預測，在NCBI上BLAST搜查同源序列對其在氨基酸水平上進行同源比對，用ClustalW和BioEdit進行同源序列比對分析。

2.2.4 實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，real-time PCR)

根據克隆所得的TfUbcE2-D2 cDNA序列設計real-time PCR的引物qRTF、qRTR(見表1)，以對照組和刺激組的各時間點的cDNA為模板，進行real-time PCR。以β-Actin為內參基因，所用引物分別為ActinF和ActinR(見表1)。具體反應體系和步驟參見SYBR○RPremix Ex TaqTM說明書。每個待測樣品cDNA設置3個平行，mRNA相對表達量根據2-ΔΔCt法計算，使用T檢驗的方法分析差異顯著性，P<0.05為可接受的顯著性差異標準[6]。

表1 本研究所用的PCR引物序列Tab.1 The sequences of PCR primers

3 實驗結果

3.1 TfUbcE2-D2基因克隆和序列分析

通過對測序結果進行拼接，得到TfUbcE2-D2的cDNA序列全長993 bp，包括5′非編碼區(qū)308 bp、3′非編碼區(qū)220 bp，開放閱讀框444 bp，編碼147個氨基酸(見圖1)。3′端有加尾信號(AATAAA)，加尾信號后16 bp處有polyA尾巴。經ExPASy在線預測，TfUbcE2-D2蛋白質分子量(MW)為16.5 kD，理論等電點(PI)為6.80。通過SignalP 4.1預測N端沒有信號肽。SMART預測發(fā)現該蛋白在第4～147位有一個結構域Ubcc，主要為泛素結合酶催化區(qū)域。

3.2 同源比對和系統(tǒng)進化樹構建

將TfUbcE2-D2蛋白分別與人(NP_862821.1Homosapiens)，白尾海雕(XP_009912166.1Haliaeetusalbicilla)，綠海龜(XP_007054447.1Cheloniamydas)，爪蟾(NP_001084434.1Xenopuslaevis)，大西洋鮭(ACN12778.1Salmosalar)，白斑狗魚(ACO13579.1Esoxlucius)，胡瓜魚(ACO09151.1Osmerusmordax)，斑點叉尾鮰(NP_001187535.1Ictaluruspunctatus)和斑馬魚(NP_957253.1Daniorerio)的UbcE2-D2 蛋白進行氨基酸比對，其相似度介于 74.15%～91.84%。10個物種氨基酸序列的同源性為92.31%(見圖2)。

通過MEGA4.0的NJ法(Neighbor-joining)，構建了羅非魚(XP_003447669.1Oreochromisniloticus)、大黃魚(XP_010752718.1Larimichthyscrocea)、紅鰭東方鲀(XP_003978539.1Takifugurubripes)、綠海龜(XP_007054447.1Cheloniamydas)、白尾海雕(XP_009912166.1Haliaeetusalbicilla)、家鼠(NP_064296.1Musmusculus)和TfUbcE2-D2的系統(tǒng)進化樹。結果顯示，松江鱸TfUbcE2-D2與同為鱸形總目的羅非魚和大黃魚的UbcE2-D2關系最近，所有魚類的UbcE2-D2單獨聚為進化樹的一大分支，其他脊椎動物的UbcE2-D2 聚為一支(見圖3)。

3.3 TfUbcE2-D2的表達分析

3.3.1 TfUbcE2-D2的組織分布

real-time PCR結果表明，TfUbcE2-D2廣泛表達于松江鱸各組織，且表達存在組織特異性，其中在腎臟的表達量最高，其次是鰓，表達量最低的是胃(見圖4)。

3.3.2 鰻弧菌刺激后TfUbcE2-D2的表達模式分析

受鰻弧菌刺激后，TfUbcE2-D2于松江鱸的脾臟、肝臟和鰓中表達量急劇上升，分別在6 h、12 h、6 h時上調至最高點。在血液中，刺激后2 h TfUbcE2-D2表達量稍有上調，為對照組的1.4倍。但是在腎臟中，受刺激后表達下調，直至實驗結束表達量仍低于正常水平(見圖5)。

4 討論

泛素-蛋白酶體途徑廣泛參與細胞凋亡、周期調控、信號轉導、轉錄調控等多種生命活動過程[5]。其中UbcE2負責在泛素和底物蛋白之間催化形成異肽鍵，擁有一個大約由150個氨基酸組成的Ubcc結構域。在該結構域內，具有一個特殊的半胱氨酸殘基，該殘基在泛素和E2酶之間形成硫酯鍵起關鍵作用[7]。本實驗結果表明TfUbcE2-D2具有一個Ubcc結構域，內含保守的半胱氨酸殘基。將TfUbcE2-D2和多個已知的其他物種泛素結合酶E2-D2進行氨基酸序列比對，發(fā)現蛋白保守度高，尤其第85位半胱氨酸殘基各物種保持一致，且其前后的氨基酸也高度保守，多為I(/V)CL。

作為參與機體基礎代謝的酶類，大部分研究表明UbcE2在維持機體自身穩(wěn)態(tài)和生殖方面發(fā)揮著重要的作用[8—10]，而陳安靜研究發(fā)現，對蝦(Penaeusorientalis)的泛素結合酶E2(FcUbc)通過介導泛素化而抑制了白斑綜合癥病毒(WSSV)的復制[4]。本研究結果顯示，TfUbcE2-D2廣泛表達于松江鱸10個組織，而在腎臟中表達量最高，鰓次之。TfUbcE2-D2表達的普遍性說明其可能在松江鱸基礎代謝方面發(fā)揮著重要的生理功能。腎臟是魚類的一個重要的免疫器官，其吞噬細胞可吞噬自身衰老細胞及病原微生物等。大菱鲆(Scophthalmusmaximus)中的趨化因子受體CCR3和CCR9[11]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)中的C-型溶菌酶[12]、紅笛鯛(Lutjanussanguineus)中的非特異性細胞毒性細胞膜受體(NCCRP-1)[13]等在腎臟中的表達量很高，另外，松江鱸的免疫相關基因硫氧還蛋白1(Trx1)[14]、髓樣分化因子MyD88[15]、CD302(未發(fā)表)等在腎中的表達量也很高。鰓是魚體內的黏膜相關淋巴組織(MALT)，內含淋巴細胞、巨噬細胞和各類粒細胞[16]，為防止生物體感染提供了關鍵的免疫監(jiān)視[17]。TfUbcE2-D2在松江鱸腎臟和鰓中高表達量表明 TfUbcE2-D2可能參與免疫。

圖1 TfUbcE2-D2的cDNA序列全長及演繹的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of TfUbcE2-D2起始密碼子和終止密碼子用粗體標注，“*”代表終止密碼子，陰影部分是UBCc結構域，加尾信號用下劃線標出，保守半胱氨酸殘基用方框標出The start and stop condons in bold，the asterisk (*) represented the stop codon，the structure domain was shown in shadow，the predicted polyadenylation signal AATAAA was underlined and conservative cysteine was shown in box

圖2 松江鱸TfUbcE2-D2和其他物種的UbcE2-D2的氨基酸多序列比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of TfUbcE2-D2 with the other UbcE2-D2 proteins using Clustal W method TfUbcE2-D2的催化位點用矩形框標出Catalytic sites of TfUbcE2-D2 was indicated with rectangular box

圖3 基于TfUbcE2-D2的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TfUbcE2-D2 with the other UbcE2-D2 proteins

圖4 TfUbcE2-D2在正常組織中的表達模式(n=3)Fig.4 Constitutive expression of TfUbcE2-D2 in different tissues of normal Roughskin soulpin(n=3)

圖5 TfUbcE2-D2受鰻弧菌刺激后不同組織表達模式變化Fig.5 Temporal expressions of TfUbcE2-D2 analyzed by real-time PCR after Vibrio anguillarum challenge柱狀圖顯示了實時定量PCR的數據分析結果，星號指示刺激組與對照組(0 h)之間的T檢驗結果，“*”表明有顯著性差異，“**”表示有極顯著差異；誤差線是通過對3次獨立實驗進行統(tǒng)計分析所得到的標準差；(* P<0.05; **P<0.01)The results of real-time PCR was expressed as histogram，the asterisk represented the differences from the control samples(*， P<0.05; **，P<0.01) .The error bars represent ±SD of three independent PCR amplifications and quantifications

受鰻弧菌刺激后，松江鱸脾臟、肝臟和鰓中的TfUbcE2-D2 表達量明顯上調，其中在脾臟和鰓中達到了40倍左右。脾臟是真骨魚中唯一的淋巴結樣器官，其黑素-巨噬細胞中心具有吞噬細胞功能，同時在體液免疫中也發(fā)揮著一定的作用[16]。魚類肝臟通過對病原體的吞噬、細菌的凝集等在宿主防御微生物入侵過程中起到非常重要的作用[18—19]。 鯉魚的Akirin2[20]經鰻弧菌刺激后，在脾和肝臟中表達量均明顯上調；松江鱸免疫相關基因C-型凝集素[21]、MyD88、 半乳糖凝集素[21]、白細胞介素-1受體相關激酶4(IRAK-4)[22]，受刺激后在脾和肝臟中均迅速上調表達 。鰻弧菌刺激后TfUbcE2-D2基因在松江鱸脾和肝臟中表達上調可能與TfUbcE2-D2迅速參與外來蛋白降解有關系。受刺激后TfUbcE2-D2在鰓中大幅上調可能與其抵抗外來病原體也有一定的關系。刺激后腎臟中TfUbcE2-D2的下調，可能是因為mRNA迅速合成蛋白用于對外來病原體蛋白的降解。但其確切下調機理有待進一步研究。

綜上所述，TfUbcE2-D2作為UPP途徑中的一個重要酶，推測其參與了松江鱸的先天免疫，并在其先天免疫中發(fā)揮重要作用。本實驗結果為研究泛素結合酶在魚類先天性免疫作用奠定了一定的基礎，也為

松江鱸的保護提供了參考，但關于其在免疫應答中的具體作用機制仍待進一步深入探討。

[1] 吳慧娟，張志剛. 泛素-蛋白酶體途徑及意義[J]. 國際病理科學與臨床雜志，2006，26(1): 7-10．

Wu Huijuan，Zhang Zhigang. Ubiquitin-Proteasome pathway and its significance[J]. Journal of International Pathology and Clinical Medicine，2006，26(1): 7-10．

[2] 董合玲，徐曉陽. 泛素—蛋白酶體途徑的組成及其生物功能[J]. 南京體育學院學報(自然科學版)，2011，10(3): 35-37．

Dong Heling，Xu Xiaoyang. The composition of ubiquitin-proteasome pathway and its biological function[J]. Journal of Nanjing Institute of Physical Education (Natural Science)，2011，10(3): 35-37．

[3] Von Kampen J，Wettem M，Schulz M. The ubiquitin system in plants[J]. Physial Plant，1996，97(3): 618-624．

[4] 陳安靜. 泛素化與類泛素(SUMO)化在甲殼動物免疫反應中的功能[D]. 濟南: 山東大學，2013．

Chen Anjing. Functional study of ubiquitination and SUMOylation in crustacean immune responses[D]. Ji’nan: Shandong University，2013．

[5] 徐豫松，王華兵. 家蠶泛素結合酶新基因的克隆與基因組結構及5′調控區(qū)分析[J]. 蠶業(yè)科學，2005，31(4): 439-443．

Xu Yusong，Wang Huabing. Analysis of a novel ubiquitin conjugating enzyme gene from Silkworm，Bombyxmori[J]. Canye Kexue，2005，31(4): 439-443．

[6] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods，2001，25(4): 402-408．

[7] 卓越，樊崢，葉棋濃，等. 人泛素結合酶9的原核表達與純化[J]. 生物技術通訊，2007，18(1): 19-21．

Zhuo Yue，Fan Zheng，Ye Qinong，et al. Expression and purification of human ubiquitin conjugating enzyme 9[J]. Letters in Biotechnology，2007，18(1): 19-21．

[8] 鄭眉. 人泛素活化酶UBE1DC1、UBE1及人泛素結合酶UBE2F的功能研究[D]. 上海: 復旦大學，2008

Zheng Mei. The function research of hunman Ubiquitin activating enzyme UBE1DC1、UBE1 and Ubiquitin Conjugating Enzyme UBE2F[D]. Shanghai: Fudan University，2008．

[9] Rajapurohitam V，Morales C R，El-Alfy M，et al. Activation of a UBC4-dependent pathway of ubiquitin conjugation during postnatal development of the Rat Testis[J]. Developmental Biology，1999，212(1): 217-228.

[10] 李游. 鱖魚泛素活化酶、泛素結合酶基因的克隆、表達和功能[D]. 廣州: 中山大學，2007．

Li You. Gene cloning，recombinant expression and fuctional research of ubiquitin activating enzyme，ubiquitin conjugating enzyme from mandarin fish，SinipercaChuatsi[D]. Guangzhou: Zhongshan University，2007．

[11] 孟艷青，劉曉飛，劉洋，等. 大菱鲆趨化因子受體CCR3和CCR9基因的克隆及組織表達[J]. 中國水產科學，2013，20(5): 918-930．

Meng Yanqing，Liu Xiaofei，Liu Yang，et al. Chemokine receptor genesCCR3 andCCR9 in turbot (Scophthalmusmaximus): Cloning and tissue distribution[J]. Journal of Fishery Sciences of China，2013，20(5): 918-930．

[12] 張莉莉. 草魚g-型和c-型溶菌酶基因的克隆、組織分布與原核表達[D]. 湛江: 廣東海洋大學，2009．

Zhang Lili. Gene cloning，tissue distribution and prokaryotic expression of g-lysozyme and c-lysozyme in grass carp，Ctenopharyngodonidellu[D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University，2009．

[13] 魏世娜. 紅笛鯛NCCRP-1基因的克隆和表達分析[D]. 湛江: 廣東海洋大學，2010．

Wei Shina. Cloning and expression analysis ofNCCRP-1 gene in crimson snapper (Lutjanussanguineus)[D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University，2010．

[14] 劉瑩瑩. 松江鱸(Trachidermusfasciatus)抗氧化相關基因的克隆、表達與功能分析[D]. 威海: 山東大學，2012．

Liu Yinying. Cloning，expression and functional analysis of antioxidant genes in roughskin sculpin (Trachidermusfasciatus)[D]. Weihai: Shandong University，2012．

[15] 畢彩紅，張秋霞，于珊珊，等. 松江鱸(Trachidermusfasciatus)髓樣分化因子MyD88基因克隆與組織表達分析[J]. 生物技術通報，2015，31(2): 135-142．

Bi Caihong，Zhang Qiuxia，Yu Shanshan，et al. Molecular cloning and expression analysis of MyD88 in Roughskin Soulpin，TrachidermusFasciatus[J]. Biotechnology Bulletin，2015，31(2): 135-142．

[16] 唐海蓉，陳仕均，王選年. 魚類免疫組織的研究進展[J]. 現代畜牧獸醫(yī)，2006(9): 52-54．

Tang Hairong，Chen Shijun，Wang Xuannian. The research progress of fish immune tissues[J]. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2006(9): 52-54．

[17] Ellis A E. Innate host defense mechanisms of fish against viruses and bacteria[J]. Developmental & Comparative Immunology，2001，25(8/9): 827-839．

[18] Kurobe T，Yasuike M，Kimura T，et al. Expression profiling of immune-related genes from Japanese flounderParalichthysolivaceuskidney cells using cDNA microarrays[J]. Developmental & Comparative Immunology，2005，29(6): 515-523．

[19] Rhee J S，Kim B M，Kim R O，et al. Analysis of expressed sequence tags from the liver and ovary of the euryhaline hermaphroditic fish，Kryptolebiasmarmoratus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics，2011，6(3): 244-255．

[20] 張曉研. 鯉魚Akirin基因的分子克隆及免疫功能研究[D]. 濟南: 山東師范大學，2010．

Zhang Xiaoyan. Molecular cloning and immunological characterization of Akirin in common carp (CyprinuscarpioL.)[D]. Ji’nan: Shandong Normal University，2010．

[21] Yu Shanshan，Yang Hui，Chai Yingmei，et al. Molecular cloning and characterization of a C-type lectin in roughskin sculpin (Trachidermusfasciatus)[J]. Fish & Shellfish Immunology，2013，34(2): 582-592．

[22] Liu Yingying，Yu Shanshan，Chai Yingmei，et al. Lipopolysaccharide-induced gene expression of interleukin-1 receptor-associated kinase 4 and interleukin-1β in roughskin sculpin (Trachidermusfasciatus)[J]. Fish & Shellfish Immunology，2012，33(4): 690-698．

Molecular cloning and expression analysis of ubiquitin-conjugating enzyme E2-D2 in roughskin sculpin，Trachidermus Fasciatus

Chen Xuezhao1，Zhang Lei1，Yu Shanshan1，Bi Caihong1，Liu Chunying1，Zhu Qian1

(1.SchoolofMarineScience，ShandongUniversity(Weihai)，Weihai264209，China)

Ubiquitin-conjugating enzyme is the second enzyme in the process of protein ubiquitination and plays an important role in ubiquitin transferring and substrate specific recognition. In this study，we cloned the full-length cDNA from the Roughskin sculpin，Trachidermusfasciatusby RACE，and named as TfUbcE2-D2. The cDNA of TfUbcE2-D2 is 993 bp，which contained an open reading frame (ORF) of 444 bp encoding a polypeptide of 147 amino acids. The deduced amino acid sequence had a domain called Ubcc，which was extremely conservative. The mRNA expression of TfUbcE2-D2 in healthy andVibrioanguillarumchallenge was detected by quantitative real-time PCR，results showed that TfUbcE2-D2 was expressed in all the detected tissues，mainly expressed in kidney and gill. The up-regulated of TfUbcE2-D2 post challenge withVibrioanguillarumin blood，spleen，liver and gill indicated that it might be involved in the innate response of Roughskin sculpin．

ubiquitin-conjugating enzyme;Trachidermusfasciatus;gene clone;innate immunity

2015-03-25；

2015-07-28。

威海市科技攻關計劃項目(0000413420608)； 威海市科委項目(1070432121313)。

陳學昭(1990—), 女，山東省臨沂市人，主要研究方向為松江鱸免疫基因。E-mail：chenxuezhao900601@163.com

*通信作者：祝茜, 博士生導師, 教授。E-mail:qianzhu@sdu.edu.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.013

Q95

A

0253-4193(2015)10-0133-08

陳學昭，張雷，于珊珊，等. 松江鱸(Trachidermusfasciatus)泛素結合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析[J].海洋學報，2015，37(10)：133—140，

Chen Xuezhao，Zhang Lei，Yu Shanshan，et al. Molecular cloning and expression analysis of ubiquitin-conjugating enzyme E2-D2 in roughskin sculpin，TrachidermusFasciatus[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(10)：133—140，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.013