紫杉醇-漢防己甲素復合納米粒的制備及其逆轉MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的研究

寧婷，李月，徐翀

(中國醫科大學附屬第一醫院藥學部，遼寧沈陽110001)

紫杉醇-漢防己甲素復合納米粒的制備及其逆轉MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的研究

寧婷，李月，徐翀

(中國醫科大學附屬第一醫院藥學部，遼寧沈陽110001)

目的制備載有紫杉醇和漢防己甲素的復合納米粒，并進行逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性研究。方法采用納米沉淀法制備紫杉醇-漢防己甲素復合納米粒，對其載藥量、包封率、粒徑進行測定，并對其體外釋放行為進行考察。采用體外細胞毒試驗和Western blot法考察復合納米粒逆轉多藥耐藥的效果。結果復合納米粒的紫杉醇和漢防己甲素載藥量分別為0.49%和0.20%，包封率分別為98.3%和99.6%，粒徑為(107.3±15.6)nm。體外釋放試驗表明，紫杉醇和漢防己甲素幾乎同步釋放。MCF7/ADR細胞毒試驗結果顯示，相比于游離紫杉醇，紫杉醇-漢防己甲素復合納米粒的IC50從6.7 μmol/L降為1.1 μmol/L。Western blot試驗結果表明漢防己甲素有效地抑制了P-gp的表達。結論中藥漢防己甲素能夠有效地改善紫杉醇對耐藥細胞株的耐藥性。

紫杉醇；漢防己甲素；納米粒；多藥耐藥性

癌癥治療目前的主要方法是化療，化療過程中產生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)常常導致達不到預期的化療效果。導致腫瘤細胞產生MDR現象的機制很多，其中由MDR-1編碼的P-糖蛋白(P-gp)過表達是目前公認的主要的耐藥機制[1-2]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是臨床上應用廣泛的一線抗癌藥物，在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等的治療中均有應用，PTX對敏感腫瘤具有良好的抗腫瘤效果，但隨著MDR的出現，PTX的抗腫瘤效果大打折扣；因此，如何逆轉MDR成為PTX臨床應用急需解決的關鍵問題。

漢防己甲素(tetrandrine，TET)是從防己科植物塊根中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有直接抑制腫瘤細胞生長、化療增敏及顯著逆轉MDR活性的作用[3-6]。聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)是美國FDA批準的可用于人體的生物可降解材料，近年來被廣泛用于組織工程及藥物載體研究中。本文采用PLGA同時包載PTX和TET，以期逆轉PTX 的MDR，增加其臨床療效，采用納米沉淀法制備雙載藥PTX/TET PLGA納米粒，測定其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等，并對其體外釋放行為以及逆轉MDR的性能進行考察。

1 材料與方法

1.1 試劑

紫杉醇(質量分數＞99.5%，武漢賽創科技有限責任公司)；漢防己甲素(質量分數＞99.0%，貝爾卡生物醫藥有限公司)；RPMI Medium 1640(美國Gibco BRL公司)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(質量比50∶50，相對分子質量90 000，大連美侖生物技術有限公司)；維生素 E聚乙二醇琥珀酸酯(D-alphatocohperyl polyethylene glycol succinate，TPGS，武漢國邦達醫藥化工股份有限公司)；小牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)；TRIzoL(Molecular Reseach Center公司)；SDS-PAGE次高分子量標準蛋白質(中國科學院上海生物化學研究所)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；Western blot試劑盒(Protein DetectorTMWestern Blot kit BCIP/NBT System，KPL公司)；P-gp兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；抗 β-actin兔多克隆抗體(美國 Abgent公司)；二抗辣根過氧化氫酶(HRP)標記的驢抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)；化學發光底物(ECL，美國Pierce公司)。

1.2 細胞株及培養

MCF7/ADR細胞是具有MDR1表型的耐藥細胞系，由中國醫學科學院血液學研究所提供。細胞接種于含質量分數10%胎牛血清的含雙抗的RPMI-1640培養液中，置于37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，2～3 d傳代1次。

1.3 載藥納米粒的制備

采用納米沉淀法制備雙載藥PTX/TET PLGA納米粒:將一定量的PTX(和)或TET與PLGA用乙醇溶解，配制成PTX質量濃度為0.5 mg/mL的乙醇溶液，移液槍移取20 μL，在攪拌過程中緩慢注入質量分數0.05%的TPGS水溶液中，持續攪拌2 h，除去乙醇，即得載藥納米溶液。

空白PLGA納米粒同此法操作即得。

1.4 納米粒的表征

吸取少量PTX/TET PLGA納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網上，滴加質量分數2%的pH 6.2磷鎢酸溶液負染，自然晾干后，于透射電子顯微鏡(JEOL 1230)下觀察納米粒形態和粒徑。取納米粒混懸液適量，加10 mmol/L NaCl稀釋后用Zetasizer Nano system粒徑分析儀測定粒子粒徑。

1.5 載藥量和包封率的測定

將PTX/TET PLGA納米粒混懸液1 000 r/min離心5 min，移液槍吸取上清液10 μL，加入乙腈90 μL，渦旋溶解，參考文獻[7-8]方法，采用日本島津的LC10AT高效液相色譜儀(HPLC)分別在 227、282 nm波長處測定PTX和TET的質量分數。

色譜條件:色譜柱為大連依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μmol/L)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，分離PTX和TET的流動相分別為乙腈-水(體積比35∶65)和甲醇-乙醚-三乙胺(體積比100∶1∶0.05)。按照以下公式計算包封率和載藥量[9]:

包封率(EE)＝[上清液中PTX(TET)的量]/[加入的PTX(TET)的總量]×100%，

載藥量(LE)＝[上清液中PTX(TET)的量]/[上清液中PTX(TET)的量＋PLGA的量]×100%。1.6 體外釋放試驗

[10]方法:pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液(含質量分數0.1%十二烷基硫酸鈉)作為釋放介質，吸取PTX/TET PLGA納米粒溶液5.0 mL于透析袋(截留相對分子質量3 500)中，并將透析袋置于250 mL的釋放介質中，于(37±0.5)℃、100 r/min條件下進行體外釋放試驗。定時取樣2 mL，并適時補充2 mL新鮮介質，平行測定3次。

1.7 體外細胞毒性試驗[11]

分別取對數生長期的MCF7/ADR細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔細胞數約為7 000～8 000個。將細胞板置于37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育，待細胞貼壁生長后，分別加入不同藥物濃度(0.01～12.5 μmol/L)的PTX、TET、PLGA空白納米粒、雙載藥PTX/TET PLGA納米粒、PTX與TET的混合物，培養48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后，吸出上清液，加入DMSO溶液150 μL，然后放置于培養箱培養10 min。用酶標儀檢測各孔490 nm處的吸光度，記錄結果，每組重復3次，每個濃度設4個復孔。

1.8 蛋白表達的Western blot檢測[9]

1.8.1 細胞總蛋白提取及蛋白含量的測定 將MCF7/ADR接種到100 mm的培養皿中，采用不同載藥納米粒分別處理，48 h后，用細胞刮收集細胞。離心濃縮各實驗組細胞，用預冷的PBS溶液漂洗細胞2次，離心棄上清后，加入預冷至0℃的裂解緩沖液1 mL，充分混勻后移入Eppendorf管中，0℃放置30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，保存蛋白樣品于－20℃。BCA法測定所抽提蛋白濃度。電泳及轉移:每道20 μL蛋白樣品，加入等量2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min后上樣，以質量分數12%SDS PAGE電泳(85 V)3 h分離蛋白后，以恒流0.9～1 mA/cm2(硝酸纖維素膜)半干電轉移2 h。1.8.2 Western blot方法 轉移后的硝酸纖維素膜以質量分數5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗P-gp(1∶200)4℃孵育過夜，之后用1×PBST洗3次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的驢抗兔多克隆二抗(1∶5 000)室溫振搖孵育1 h，用1×PBST洗滌4次除去未結合的二抗，用ECL試劑盒曝光顯影。內參選用β-actin。

2 結果

2.1 納米粒的制劑學性質

通過調節PTX、TET與PLGA的比例，考察不同載藥量及載藥比納米粒的包封率和載藥量，結果見表1。可見，隨著藥物與PLGA質量比的增加，PTX/ TET PLGA納米粒的載藥量和包封率都有下降趨勢；固定處方中PTX與PLGA的比例，調節TET的比例，結果發現，隨著TET的增加，PTX與TET在PLGA納米粒中的載藥量和包封率均有下降趨勢；因此，選取處方3進行后續研究，其典型透射電鏡圖見圖1，動態光散射粒徑測定結果見圖2，平均粒徑為(107.3±15.6)nm(n＝3)。

表1 PTX和TET與PLGA的比例對雙載藥納米粒的載藥量和包封率的影響(n＝3)Table 1 The effects of the ratios between PLGA and PTX and TET on the drug loading and the encapsulation efficiency

圖1 PTX/TET PLGA納米粒的透射電子顯微鏡圖Figure 1 The transmission electron microscopy of PTX/TET PLGA nanoparticles

圖2 PTX/TET PLGA納米粒的動態光散射粒徑Figure 2 The DLS particle size of PTX/TET PLGA nanoparticles

2.2 體外釋放試驗

體外釋放結果(見圖3)表明，PTX/TET PLGA納米粒PTX和TET的釋放均較緩慢，在12 h的累積釋放率分別為26.0%和23.3%，72 h的累積釋放率分別為58.2%和53.0%，二者釋放基本同步，這將保證雙載藥PTX/TET PLGA納米粒在腫瘤細胞內同時釋放藥物，以有效的產生協同作用。

圖3 PTX/TET PLGA納米粒的釋放曲線Figure 3 The release profiles of PTX/TET PLGA nanoparticles

2.3 體外細胞毒性試驗

從圖4可見，空白PLGA納米粒對MCF7/ADR細胞幾乎沒有抑制作用，TET的抑制作用也較弱，PTX/TET PLGA納米粒呈現最強的腫瘤細胞抑制作用。根據抑制率和濃度的關系，采用IC50計算軟件計算藥物的IC50值，PTX、PTX與TET的混合物、雙載藥PTX/TET PLGA納米粒作用于MCF7/ADR細胞48 h后的 IC50值計算結果分別為6.7、2.7、1.1 μmol/L，表明TET顯著提高了PTX的體外抗腫瘤活性。

圖4 各藥物作用于MCF7/ADR細胞48 h后細胞的生長情況Figure 4 The cytotoxicities of the drugs against MCF7/ADR cells after 48 h incubation

2.4 TET對P-gp的影響

據文獻[12-14]報道，TET可通過抑制P-gp產生克服MDR的作用；因此，本文分別對PTX、TET、PTX與TET的混合物、以及雙載藥納米粒對P-gp的表達量進行了檢測，結果見圖5。結果顯示，PTX給藥輕微上調了P-gp的表達量，而TET的加入能顯著下調MCF7/ADR細胞中P-gp的表達，納米粒復合給藥后，對P-gp表達的抑制作用更明顯，這也是雙載藥納米粒細胞毒性顯著強于單獨游離藥物細胞毒性的原因之一。

圖5 不同藥物對MCF-7/ADR中P-gp表達的影響Figure 5 Effects of MCF-7/ADR cells on P-gp expression of various kinds of formulations

3 討論

目前，研究耐藥的相關機制和尋找有效逆轉MDR已經成為腫瘤研究的熱點。研究表明，P-gp的過表達是產生耐藥性的主要原因之一[1-2]。關于P-gp抑制劑的研究很多，但所報道的抑制劑大多會產生不良作用。中藥作為P-gp抑制劑較其他化學抑制劑有很多優點:作用靶點多，具有一定的腫瘤細胞殺傷作用，具有化療增敏作用等[15-16]。這其中，TET逆轉MDR的作用逐漸引起重視[13]。本文結果表明，通過有效抑制P-gp的表達，雙載藥PTX/TET PLGA納米粒對MCF7/ADR細胞的殺傷力顯著高于其他對照組。

在細胞毒以及對P-gp抑制作用的試驗中，發現PTX/TET復合納米粒的作用效果均比PTX、TET單獨給藥或者混合給藥要好，這可能是由于藥物單獨給藥時，由于藥物溶解度小，導致在細胞培養介質中形成沉淀析出，從而導致細胞攝取量減少；而復合納米粒給藥時，藥物包封在納米載體中，可通過內吞作用攝取進入細胞中。

另外，本文結果表明，采用PLGA裝載PTX和TET具有良好的同步緩釋性能，這為兩藥協同作用的產生奠定了基礎，但是藥物的體外行為并不能完全反映其體內行為，還需要進一步對其藥動學和體內藥效學進行研究。

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(責任編輯:陳翔)

The preparation of paclitaxel-tetrandrine combined nanoparticles and its effect on overcoming multidrug resistance of MCF-7/ADR cells

NING Ting，LI Yue，XU Chong
(Department of Pharmacy，The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

ObjectiveTo prepare combined nanoparticles loading paclitaxel and tetrandrine and study its effect on overcoming multidrug resistance of tumor cells.MethodsThe combined nanoparticles were prepared using nano-precipitation methods.The drug loading，encapsulation efficiency and particle size were determined，and the release behavior in vitro was investigated.The effect of overcoming multidrug resistance was studied using MTT assay and Western blot assay.ResultsThe loading efficiency of the combined nanoparticles for paclitaxel and tetrandrine were 0.49%and 0.20%，respectively.The encapsulation efficiency of the combined nanoparticles for paclitaxel and tetrandrine were 98.3% and 99.6%，respectively.The mean particle size of prepared nanoparticles was(107.3±15.6)nm.In vitro release experiment showed that paclitaxel and tetrandrine were simultaneously released.Compared with free paclitaxel，the combined nanoparticles decreased IC50value from 6.7 μmol/L to 1.1 μmol/L.Western blot assay showed that the expression of P-gp was inhibited by tetrandrine.ConclusionsTraditional Chinese medicine tetrandrine could overcome the multidrug resistance of paclitaxel effectively.

paclitaxel；tetrandrine；nanoparticles；multidrug resistance

R944.9

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.002

1006-8783(2015)05-0566-05

2015-06-20

寧婷(1981—)，女，碩士，主管藥師，主要從事藥物新劑型的研究，電話:024-83282494，Email:nting1981＠163.com。

時間:2015-09-28 15:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150928.1522.006.html