三棱抗氧化提取物提取工藝優化研究

關石鳳，管淑玉，李洋，陳典，曾宇，陳超

三棱抗氧化提取物提取工藝優化研究

關石鳳1，2，管淑玉1，3，4，李洋1，陳典1，曾宇1，3，4，陳超1，3，4

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學院 附屬第一醫院，廣東 廣州510080；3.國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東廣州510006；4.廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東廣州510006)

目的優化三棱抗氧化有效成分提取工藝。方法以三棱提取物對1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)清除率為響應值，以乙醇體積分數、提取時間、液料比為考察因素，采用響應面分析法優化三棱的提取工藝。結果響應面分析法得出三棱抗氧化有效成分的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數為72%，液料比為20∶1(mL∶g)，提取時間為1 h，提取2次。在此條件下三棱清除率為57.28%，與理論值56.59%基本相符。結論通過響應面分析法優化三棱抗氧化物質提取工藝條件簡單可行，可用于三棱中抗氧化有效成分的提取。

三棱；抗氧化；響應面分析法；提取工藝優化

三棱系黑三棱科植物黑三棱 Sparganium stoloniferumBuch.-Ham削去外皮的干燥塊莖，味苦、性平，入肝、脾經，具有破血行氣、消積止痛等功效，是活血化瘀的常用中藥[1]，臨床多用醋制品。本課題組前期研究發現，醋三棱提取物有較強的抗氧化活性，本研究通過響應面分析法優選三棱抗氧化活性成分的提取工藝，為三棱藥材資源的開發和綜合利用提供依據。

1 儀器與試藥

醋三棱藥材(批號:141001)購于廣東致信中藥飲片有限公司，經廣東藥學院中藥學院劉基柱副教授鑒定為黑三棱科黑三棱Sparganium stoloniferum Buch-Ham干燥塊莖醋制品，符合《中國藥典》2010年版規定；95%(體積分數，下同)乙醇(天津百世化工有限公司，分析純，批號:20130928)；鹽酸(廣州市東紅化工廠，分析純，批號:20100320)；1，1-二苯基-2-苦肼基[DPPH，阿拉丁試劑(上海)有限公司，分析純，批號:K1319045]；水為超純水。

UV2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)；HH-4恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；FA10048B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 藥材與試劑的前處理

2.1.1 三棱藥材的處理 稱取三棱藥材粗粉1 g，乙醇回流提取2 h，濾過，備用。

2.1.2 0.1 mmol/L DPPH溶液的配制 精密稱定DPPH 3.94 mg，加95%乙醇使溶解，并用95%乙醇定容至100 mL量瓶中，置于冰箱，備用。

2.2 DPPH自由基的清除試驗

分別量取各提取液2 mL于試管中，分別加入DPPH溶液2 mL，搖勻，置于陰暗處反應30 min，在517 nm處測定吸光度值，記為Ai；再分別量取提取液2 mL，分別加入95%乙醇2 mL，搖勻，置暗處30 min測吸光度值，記為Aj；再分別量取95%乙醇2 mL，分別加入DPPH溶液2 mL，搖勻，置暗處30 min后測吸光度值，記為A0。按以下公式計算清除率:清除率＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100%。

2.3 響應面試驗設計優化提取工藝

依據預試驗結果，固定提取次數為2次，選取乙醇體積分數、液料比、提取時間為響應變量，試驗的因素與水平見表1，根據Box-Behnken中心組合設計建立三因素三水平數學模型[2]，以DPPH清除率(Y)為響應值，利用Design Expert 8.05b軟件對表2數據進行擬合，得到DPPH清除率(Y)對乙醇體積分數(A)、液料比(B)、提取時間(C)的二次多項回歸模型:Y＝49.53－2.76A＋7.19B＋11.08C＋7.20AB－9.93AC－3.29BC－9.06A2－1.33B2－13.66C2。

表1 響應面試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應面法設計與試驗結果Table 2 The design and test results of the response surface method

由表3可知，回歸模型的P＜0.01，表明該模型整體達到高度顯著水平，即用該回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，因變量與全體自變量之間的關系是顯著的，說明該方法是可靠的。失擬項P＝0.065 7＞0.05，差異沒有統計學意義，表明無失擬因素存在，因此可以用該模型分析和預測三棱抗氧化有效成分提取。各因素中一次項A(乙醇體積分數)和二次項A2對抗氧化成分的提取影響差異有統計學意義(P＜0.01)，一次項C(液料比)和二次項AB、B2對抗氧化成分的提取影響差異有統計學意義(P＜0.05)；而B、AC、BC、C2對抗氧化成分的提取影響差異沒有統計學意義(P＞0.05)，表明各影響因素與抗氧化成分提取率之間不是簡單的線性關系。此外，從P值可看出各因素對三棱抗氧化提取物提取率的影響從大到小排列次序為A＞C＞B，即乙醇體積分數＞液料比＞提取時間。

表3 響應面分析擬合回歸模型的方差分析結果Table 3 The results of variance analysis of fit regression model by response surface

響應面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反映出交互效應的強弱趨勢，如果響應面坡度相對較平緩，表示可以忍受處理條件的變異，而不影響響應值大小；相反，如果坡度非常陡峭，表明處理條件的變異對響應值的影響非常大，即響應值對于處理條件的改變非常敏感[3]。如果等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[4]。為確定乙醇體積分數、液料比、提取時間3個因素和交互作用對三棱抗氧化提取物清除率的影響，固定乙醇體積分數、液料比、提取時間3個因素中任意一個變量為0，分別考察其余2個變量對三棱抗氧化提取物清除率的影響，結果見圖1～圖3。可見，3個因素之間的交互作用對三棱抗氧化活性成分的清除率的影響均不顯著，表現為曲線較平滑，與方差分析結果相一致。

圖1 乙醇體積分數和液料比對清除率影響的響應面和等高線Figure 1 The response surface and contour of ethanol volume fraction and the ratio of feed to liquid on the removal rate

圖2 提取時間和乙醇體積分數對清除率影響的響應面和等高線Figure 2 The response surface and contour of the extraction time and ethanol volume fraction on the removal rate

圖3 液料比和提取時間對清除率影響的響應面和等高線Figure 3 The response surface and contour of the ratio of material to liquid and extraction time on the removal rate

2.4 最佳提取工藝及驗證

通過Design Expert 8.05b軟件得到的三棱抗氧化最佳提取工藝為乙醇體積分數72.44%，液料比20∶1(mL∶g)，提取時間為1.06 h，提取2次，清除率理論值為56.59%，考慮實際操作方便性，選擇最佳提取工藝參數:乙醇體積分數為72%，液料比為20∶1 (mL∶g)，提取時間為1 h，提取2次。按最佳工藝進行3次平行驗證試驗，得到DPPH自由基平均清除率為57.28%，與Design Expert 8.05b軟件得到的理論值相比，相對誤差為1.21%，表明優化結果可靠。

3 討論

據文獻報道，多數活血化瘀藥如紅花、丹參等均具有抗氧化活性。紅花具有一定的清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，尤其對羥自由基的清除效果很好，清除率達98.31%[5]。丹參中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B均有較好清除超氧陰離子活性[6]。三棱是常用的活血化瘀藥，其抗氧化活性尚未見文獻報道，本研究首次發現三棱的抗氧化活性，為尋找高效、低毒的抗氧化新藥及天然抗氧化劑提供理論依據。

響應面法的優點是在試驗條件優化過程中可以連續地對試驗因素的各個水平進行分析，克服了正交試驗只能對一個個孤立的試驗點進行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，所以響應面法被廣泛應用于試驗設計與工藝優化研究[7]。本文結果發現，提取三棱抗氧化活性成分影響最主要的因素是乙醇體積分數，最佳提取工藝乙醇體積分數為72%，而提取黑三棱中黃酮類化合物的最佳工藝條件為乙醇體積分數66%[8]，據此推斷，三棱抗氧化活性可能與三棱中黃酮類化合物有關，具體成分有待進一步研究。

[1]戴仕林，吳啟南，殷婕.中藥三棱的現代研究進展[J].中國民族民間醫藥，2011，17(1):63-64.

[2]侯淑珍，王景媛，王娜，等.響應面分析法優化牛蒡根多糖提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(11): 21.

[3]陳莉，屠康，王海，等.采用響應面法對采后紅富士蘋果熱處理條件的優化[J].農業工程學報，2006，22(2): 159-163.

[4]徐媛，王魯峰，徐曉云，等.響應面法優化紅葡萄柚番茄紅素的提取工藝[J].食品科學，2010，31(22):255-259.

[5]馮濤，閻婷婷，閻國榮，等.紅花提取物清除自由基能力的初步研究[J].天津農學院學報，2010，17(1):6-9.

[6]夏鑫華，劉梅，張志敏，等.丹參中水溶性成分體外抗氧化活性研究[J].中華中醫藥學刊，2009，27(5):1085-1087.

[7]徐秀泉，虞倩，徐穎.趕黃草總黃酮超聲提取工藝的響應面法優化及其體外抗氧化活性分析[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(18):38.

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(責任編輯:陳翔)

Study on optimization of extraction process of Rhizoma Sparganii antioxidative components

GUAN Shifeng1，2，GUAN Shuyu1，3，4，LI Yang1，CHEN Dian1，ZENG Yu1，3，4，CHEN Chao1，3，4
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmacutical University，Guangzhou 510006，China；2.The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmacutical University，Guangzhou 510080，China；3.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；4.Engineering＆Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo optimize the extraction process of Rhizoma Sparganii antioxidant components was optimized by using Rhizoma Sparganii as raw materials.MethodsRhizoma Sparganii extractive on DPPH scavenging rate as response value，response surface methodology was used to optimize the extraction process by using volume fraction of ethanol，extraction time，liquid-solid ratio as factors.ResultsThe optimum conditions were as follows:the volume fraction ethanol 72%，liquid-solid ratio 20∶1(mL∶g)，extraction duration 1 h and extracting times twice.The Rhizoma Sparganii clearance rate was 57.28%，which was roughly in line with the theoretical value of 56.59%.ConclusionIt is simple and feasible to optimize the extraction of active ingredients of Rhizoma Sparganii antioxidant by using the response surface methodology，which can be used to extract the active ingredients of Rhizoma Sparganii antioxidant.

Rhizoma Sparganii；antioxidant； response surface methodology； extraction process optimization

R284.2

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.005

1006-8783(2015)05-0581-04

2015-07-16

國家自然科學基金項目(81001702)；廣州市產學研協同創新重大專項項目(201508020016)

關石鳳(1985—)，女，2012級在職碩士研究生，從事中藥質量控制研究，Email:fengguan063＠163.com；通信作者:管淑玉(1976—)，女，博士，副教授，從事中藥質量控制與生物活性研究，Email:guanshy3＠163.com。

時間:2015-09-25 14:20

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1420.004.html