玉竹多糖的硫酸酯化及其對HepG-2細胞體外抑制活性研究

王強，李鐘，張維維，陳菊英，劉塔斯

(1.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208)

玉竹多糖的硫酸酯化及其對HepG-2細胞體外抑制活性研究

王強1，李鐘1，張維維1，陳菊英1，劉塔斯2

(1.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208)

目的對玉竹精制多糖進行硫酸酯化，并分析其體外抗腫瘤活性的變化。方法采用三氧化硫-吡啶法對水溶性玉竹多糖進行硫酸酯化修飾，紅外光譜分析光譜性質的變化。采用HepG-2細胞對水溶性玉竹多糖及其硫酸酯的體外抗腫瘤活性進行評價。結果玉竹中性多糖(POPZ80)取代度可達1.23，酸性多糖(POPS80)取代度可達0.26；水溶性玉竹多糖硫酸酯化后的體外抑制HepG-2活性明顯增強，且在一定質量濃度范圍內，抑制率與用藥劑量呈正相關。結論玉竹精制多糖經硫酸酯化后體外抗腫瘤活性增強。

玉竹精制多糖；多糖硫酸酯化；硫酸基取代度；HepG-2；體外抗腫瘤活性

玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum (Mill.)Druce的干燥根莖，味甘、微寒，具有養陰潤燥、生津止渴的功能[1]。玉竹多糖為玉竹的主要成分。研究表明，玉竹多糖對血壓、心率、血糖有調節作用[2]，對腫瘤細胞有明顯的抑制作用[3]。研究發現，對多糖進行適當的分子修飾能夠提高原有的活性或者促使新的活性產生[4]。例如，香菇多糖硫酸酯化后，其抗氧化、抗腫瘤、抗病毒能力明顯增強[5-8]。目前，國內外對玉竹的研究主要集中在玉竹粗多糖的藥理活性及一級結構解析，在玉竹精制多糖乃至玉竹多糖硫酸酯化衍生物活性方面的研究報道不多，而多糖的衍生化研究是近期多糖研究的熱點。本研究期望通過硫酸酯化的方法獲得具有更高生物活性的水溶性玉竹多糖，為多糖的改性研究提供一定的理論依據。

1 材料與儀器

玉竹由湖南新邵玉竹GAP基地提供，經湖南中醫藥大學藥學院劉塔斯教授鑒定為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce；DEAE-52纖維素(上海恒信公司)；SephadexG-100(上海江萊生物科技有限公司)；大孔吸附樹脂AB-8(南開大學化工廠)；RPMI 1640細胞培養基(Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物公司)；MTT、透析袋(Sigma)；三氧化硫吡啶復合物(阿拉丁)。其余試劑均為國產分析純。HepG-2細胞(廣東藥學院生物活性重點實驗室提供)。

NICOLET 5700型紅外光譜儀(美國尼高力公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；ALpha1-2型真空冷凍干燥機(Chirst公司)；N-1100型旋轉蒸發儀(東京理化)；BS-100A型自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏公司)。

2 方法

2.1 水溶性玉竹多糖的提取

將干燥的玉竹切片、粉碎，過60目篩，準確稱取玉竹粉末，加入石油醚回流提取2次，每次2 h，除去玉竹中的脂溶性成分。濾過，將濾渣干燥。以水為溶媒，在料液比為1∶15(g∶mL)、溫度80℃、時間2 h的條件下回流提取2次，合并2次提取液，減壓濃縮[9]。

2.2 精制水溶性玉竹多糖的制備及理化性質測定

水溶性玉竹多糖液經AB-8樹脂靜態除色后減壓濃縮，采用酶法＋Sevage除蛋白。用體積分數95%乙醇分別醇沉到60%和80%，冷凍干燥，分別得到60%醇沉粗多糖(POP60)和80%醇沉粗多糖(POP80)。本文主要以POP80為原料，將 POP80分別過DEAE-52、SephadexG-100柱得玉竹精制多糖，冷凍干燥備用[10]。硫酸苯酚、I-KI[11]、考馬斯亮藍[12]、FeCl3[13]反應測定精制多糖純度。

2.3 水溶性玉竹多糖的硫酸酯化

取精制多糖500 mg，加入到適量甲酰胺(已除水)中，攪拌溶解后加入適量的三氧化硫吡啶復合物，反應過程中不斷充入N2。充分反應后將反應液移至冰水中，調節溶液pH至7～8之間。加入4倍體積的無水乙醇醇沉，密封放入4℃冰箱沉淀12 h，離心收集沉淀，加甲醇洗滌直至無吡啶氣味[14]。加少量去離子水溶解于透析袋中，先用自來水透析1～2 d，再用去離子水透析2 d，每天換3～4次水。將透析液濃縮后冷凍干燥，得硫酸酯化多糖。

2.4 硫酸基的質量分數測定及取代度計算

采用BaSO4濁度法測定硫酸基的質量分數，以Na2SO4為標準物繪制硫酸基質量分數標準曲線[15]。精確稱取經105℃干燥至恒重的Na2SO4固體，溶于去離子水中，配置成質量濃度為1.0 mg/L的標準溶液。精確吸取0～1.0 mL標準溶液(按0.2 mL遞升，即分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL)置于比色管中，各管用去離子水補加至總體積8.0 mL，另加質量分數為8%的三氯乙酸1 mL和BaCl2-明膠試液1 mL，混合后在室溫下靜置15～20 min，以確保硫酸根離子和BaCl2中的鋇離子充分反應，而且生成的BaSO4沉淀能夠均勻分散在石英比色皿中。于波長360 nm下測定吸光度，得吸光度A1；另以同樣標準溶液系列，唯以明膠試液代替BaCl2-明膠試液做對照，于波長360 nm下測定吸光度，得吸光度A2，以A1－A2的值對硫酸根濃度做標準曲線。按取代公式:DS＝1.62×S%/(32－1.02×S%)計算硫酸基質量分數，式中DS表示取代度，S%表示硫酸根質量分數。

2.5 紅外光譜分析

取玉竹多糖及多糖硫酸酯樣品2 mg，以KBr壓片，在4 000～400 cm－1區間掃描紅外吸收光譜。2.6 體外抗腫瘤試驗

利用MTT法評價水溶性玉竹多糖硫酸酯化前后抑制人肝癌細胞HepG-2的活性。取對數生長期的人肝癌細胞HepG-2培養于RPMI 1640完全培養液中，放入37℃的CO2培養箱中培養。接種時細胞濃度調整為4×105個/mL，將細胞加入96孔培養板中，每孔200 μL，置于37℃、5%(φ)CO2培養箱培養12 h，再加入用磷酸緩沖液稀釋成不同濃度的多糖液10 μL。空白對照組加入等體積的PBS液，每組設4個復孔，將細胞培養板移入CO2培養箱中，培養48 h后用MTT法于490 nm波長下測定吸光度(A)，按公式:抑制率＝(A對照組－A給藥組)/A對照組× 100%，計算腫瘤細胞增殖抑制率。

3 結果與分析

3.1 水溶性玉竹多糖純化結果

POP80經DEAE-52、SephadexG-100柱得到2種精制多糖，分別為中性多糖(POPZ80，neutral polysaccharide) 和 酸 性 多 糖 (POPS80，acid polysaccharide)，經紫外分析、I-KI反應、考馬斯亮藍反應、FeCl3反應，結果顯示多糖不含蛋白質、淀粉、多酚類物質。硫酸苯酚法測得多糖質量分數為98.6%。3.2 水溶性玉竹多糖硫酸酯化結果

硫酸基質量在20～100 μg之間線線性關系良好，回歸方程為:y＝0.012 5x－0.121 2，R2＝0.999 1。多糖能獲得最高的取代度(1.23)。

3.3 玉竹精制多糖及其硫酸酯的紅外光譜圖

玉竹酸性糖 POPS80與玉竹酸性糖硫酸酯POPSS80，玉竹中性多糖POPZ80與玉竹中性多糖硫酸酯POPZS80的紅外圖譜見圖1～圖2。

由圖 1～圖 2可知，POPZS80、POPSS80與POPZ80、POPS80紅外光譜有較明顯的差異，除了玉竹精制多糖特征吸收峰外，還增加了2個吸收峰: 1 260 cm－1左右處出現—OSO3—的S＝O拉伸振動特征吸收峰，812 cm－1左右處出現C—O—S的拉伸振動特征吸收峰，以上2組吸收峰表明分子內存在硫酸基(—O—SO3)。由以上分析可以初步鑒定水溶性玉竹多糖成功硫酸酯化[16]。

圖1 玉竹酸性糖POPS80與玉竹酸性糖硫酸酯POPSS80的紅外光譜Figure 1 The IR spectrum of POPS80 and POPSS80

圖2 玉竹中性糖POPZ80與玉竹中性糖硫酸酯POPZS80的紅外光譜Figure 2 The IR spectrum of POPZ80 and POPZS80

3.4 體外抗腫瘤試驗

不同濃度水溶性玉竹多糖及其硫酸酯(其中POPZ80、POPS80取代度分別為1.23，0.26)對HepG-2腫瘤細胞體外增殖抑制作用見圖3～圖4。

圖3 POPZ80與POPZS80對HepG-2腫瘤細胞的體外生長抑制率Figure 3 The Inhibition rate of POPZ80 and POPZS80 on the growth of HepG-2 cells in vitro

由圖3可知，POPZ80對HepG-2腫瘤細胞無抑制作用，POPZS80對HepG-2腫瘤細胞的抑制率可達44.3%；由圖 4可知，POPS80未硫酸酯化前已對HepG-2腫瘤細胞有一定的抑制作用，在用藥劑量增加到400 μg/L時，抑制率可達55%，且在一定質量濃度范圍內，抑制率與質量濃度呈正相關，表明經過硫酸酯化后，玉竹多糖的體外抗腫瘤活性明顯提高。

4 討論

本文采用三氧化硫-吡啶法對水溶性玉竹多糖進行硫酸酯化，此方法操作安全、簡便。試驗過程中發現，雖然提高反應溫度、延長反應時間能夠增加多糖硫酸取代度，但同時多糖降解也很嚴重，且多糖硫酸酯得率并不高。通過試驗還發現，POPS80對HepG-2有體外抑制活性，而POPZ80對HepG-2腫瘤細胞無明顯抑制作用，這可能與多糖分子質量、結構組成有關。二者硫酸酯化后對HepG-2細胞有明顯的抑制作用，且有明顯的濃度依賴關系，這可能是由于玉竹多糖糖單位的羥基被硫酸基基團取代后，糖環構象發生扭曲或轉變，容易形成非共價鍵，而且這些陰離子基團間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長，部分硫酸基有可能和糖環上的羥基形成氫鍵，因而在糖鏈局部形成螺旋結構，呈有活性的高級構象，且有序性增大，從而增強多糖的活性[16]。

對多糖進行結構修飾是為了獲得活性更大的多糖及多糖衍生物，目前本研究只做了一種硫酸取代度下不同玉竹多糖硫酸酯體外抗腫瘤活性，而玉竹多糖硫酸酯活性與硫酸基團取代度之間關系，硫酸基團引入后玉竹多糖的空間結構變化如何導致生物活性改變還有待進一步的研究。

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(責任編輯:陳翔)

Sulfated modification of water-soluble Polygonatum odoratum polysaccharides and its inhibiting effect on growth of HepG-2 cells in vitro

WANG Qiang1，LI Zhong1，ZHANG Weiwei1，CHEN Juyin1，LIU Tasi2
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhuo 510006，China；2.School of Pharmacy，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China)

ObjectiveTo sulfate refined polysaccharide extracted from Polygonatum odoratum and analysis the change in its anti-tumor activity in vitro.MethodsWater-soluble polysaccharide isolated from Polygonatum odoratum were chemically modified by using sulfur trioxide-pyridine.The changes in spectral properties of sulfated polysaccharide were analyzed by FT-IR spectroscopy.The HepG-2 cells were used to evaluate the in vitro anti-tumor activity of polygonatum polysaccharide and sulfated polysaccharide.ResultsThe degree of sulfation of POPZ80(neutral polysaccharide)and POPS80(acid polysaccharide)could reach 1.23 and 0.26.The sulfated derivatives could significantly inhibit the growth of HepG-2 cells.The inhibition rate was positively correlated with the concentration in the certain concentration range.ConclusionThe in vitro antitumor activity of refined Polygonatum odoratum polysaccharide was enhanced after sulfated modification.

Refined Polygonatum odoratum polysaccharide；sulfation of polysaccharide；degrees of sulfation；HepG-2；in vitro antitumor activity

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.006

1006-8783(2015)05-0585-04

2015-07-27

國家科技部支撐計劃項目(SQ2010BAJY1411-09)

王強(1990—)，男，2013級碩士研究生；通信作者:李鐘(1973—)，女，副教授，碩士研究生導師，從事中藥質量與資源的研究，Email:lizhongi＠126.com。

時間:2015-10-09 15:34

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151009.1534.002.html