橘核質量標準的優化研究

黃天山，王曉清，羅嘉琪，王淑美，孟江，于江泳，梁生旺

橘核質量標準的優化研究

黃天山1，王曉清2，羅嘉琪1，王淑美1，孟江1，于江泳3，梁生旺1

(1.廣東藥學院中藥學院/國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室/廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東廣州510006；2.鄭州澍青醫學高等專科學校藥學系，河南鄭州450000；3.國家藥典委員會，北京100050)

目的完善橘核藥材的質量標準。方法采用2010年版《中國藥典》中方法對橘核藥材中的水分、灰分及浸出物進行測定，并對薄層鑒別的條件及指標成分的高效液相色譜測定條件進行了優化。結果測定橘核藥材中水分不得超過7.0%，總灰分不得超過5.0%，95%乙醇熱浸出物不得少于34.0%，橘核檸檬苦素質量分數不得低于0.49%、諾米林質量分數不得低于0.46%；薄層鑒別斑點清晰，易于識別。結論橘核藥材的水分、灰分、浸出物、薄層鑒別、指標成分質量分數研究可為橘核藥材質量標準的修訂、提高提供方法與依據。

橘核；質量標準；薄層鑒別；高相液相色譜法

橘核為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子[1]356，始載于五代時期著名的本草書《日華子本草》[2]，能“治腰痛，膀胱氣，腎疼”。現代研究表明，橘核具有的鎮痛消炎、抗腫瘤作用，以及對睪丸腫痛、乳癰腫痛的治療與古籍記載基本吻合[3-6]。

近年來，有關橘核及其炮制品化學成分、藥理作用的研究報道很多[7-12]，但關于其質量標準的研究卻很少，2010年版《中國藥典》也僅對橘核的來源、性狀、顯微及其炮制方法進行了相關規定，不能滿足全面控制橘核藥材質量的要求。為進一步提高橘核的質量控制水平，規范其質量，本試驗在現行版藥典質量標準的基礎上，對12批不同產地橘核從薄層鑒別、水分、灰分、浸出物、質量分數測定等5方面進行了研究，并建立了相應的標準。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Luna 5 μm C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-500E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius AG十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；雙槽薄層層析缸(10 cm×10 cm，10 cm× 20 cm)；2F-20D暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；定量毛細管(美國Drummond公司)；玻璃薄層板(5 cm×10 cm，10 cm×20 cm)；GZX-9240 MBE數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；SX2-4-10型高溫箱形電爐(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；坩堝鉗，坩堝。

流動相用乙腈、甲醇均為歐普森色譜純，水為超純水；其他試劑石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、H3PO4均為分析純。

檸檬苦素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:800-200102)；諾米林對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:130118002)；食鹽(中鹽長江鹽化有限公司，批號:20130806XG)。橘核藥材分別購于廣州市清平藥材市場、廣東普寧藥材市場、廣州致信藥業有限公司等，經廣東藥學院中藥學院李書淵教授鑒定為蕓香科植物Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子。具體來源見表1。

表1 12批橘核藥材的來源Table 1 Source of 12 batches of C.reticulata

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

分別取12批藥材細粉，各1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入石油醚20 mL，超聲處理30 min，濾過。濾渣揮干石油醚，加入二氯甲烷20 mL，超聲 30 min，濾過。濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另稱取對照品檸檬苦素、諾米林各適量，分別加甲醇配成質量濃度均為1 mg/mL的檸檬苦素對照品溶液、諾米林對照品溶液，即得。按照薄層色譜法[1]附錄34-35試驗，分別吸取上述3種溶液4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比4∶1)為展開劑，在室內環境條件下展開。取出，晾干，噴以二甲氨基卞亞基羅丹寧∶硫酸∶乙醇(體積比1∶2∶97)顯色劑，在105℃加熱5 min至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，見圖1。

圖1 12批橘核藥材的薄層色譜圖Figure 1 TLC chromatogram of C.reticulata

2.2 水分的測定

由于橘核不含揮發油成分，故其水分測定采用2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅺ-H中的第一法，即烘干法[1]附錄52-53。取供試品2 g，平鋪于干燥至恒定質量的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在105℃烘箱干燥5 h。將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱定質量，至連續2次稱定質量的差異不超過5 mg為止。根據損失的質量，計算供試品中水分質量分數。

12批橘核水分質量分數分別為4.72%、5.94%、6.48%、5.85%、5.67%、5.70%、5.49%、6.08%、5.88%、5.65%、6.07%、5.79%，其平均值為5.78%，將橘核水分限量暫定為不得超過7.0%。

2.3 灰分測定[1]附錄53

2.3.1 總灰分測定法 取供試品(過2號篩)4.0 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質量(準確至0.01 g)，緩緩熾熱(注意避免燃燒)，至完全炭化時，逐漸升高溫度至600℃，使完全灰化并至恒定質量。根據殘渣質量，計算供試品中總灰分的質量分數。12批樣品的測定結果分別是 3.97%、3.91%、3.93%、3.60%、3.78%、3.60%、3.62%、3.98%、4.01%、3.72%、3.94%、3.85%，其總灰分質量分數平均值為3.83%，將橘核總灰分限量暫定為不得超過5.0%。2.3.2 酸不溶性灰分測定法 取“2.3.1”項所得的灰分，在坩堝中小心加入稀HCl約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內的殘渣用水洗于濾紙上，洗滌液用AgNO3溶液檢測，至洗液不顯氯化物反應為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒定質量。根據殘渣質量，計算供試品中酸不溶性灰分的質量分數。12批樣品的測定結果分別是0.018 6%、0.085 6%、0.047 0%、0.086 9%、0.022 8%、0.049 0%、0.045 7%、0.051 1%、0.071 4%、0.011 1%、0.031 6%、0.076 1%，平均值為0.049 7%。從以上數據可以看出，12批橘核中酸不溶性灰分極低，故暫定不測酸不溶性灰分。

2.4 浸出物的測定[1]附錄62

采用熱浸法測定。取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加入95%(體積分數，下同)乙醇100 mL，塞緊，稱定質量。靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，塞緊，再稱定質量，用95%乙醇補足損失的質量，搖勻，用干燥濾器濾過。精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒定質量的蒸發皿中。在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的質量分數。12批樣品的測定結果分別是 46.39%、45.22%、39.66%、39.45%、41.88%、41.73%、42.94%、43.33%、43.88%、42.12%、40.89%、42.61%，其平均值為42.51%，將橘核醇溶性浸出物限量暫定為不得低于34.0%。

2.5 檸檬苦素、諾米林的質量分數測定[13]

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Luna 5 μm C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(體積比62∶38)；柱溫為35℃；檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液10 μL，按上述條件進樣測定，檸檬苦素、諾米林的保留時間分別為5.526、6.698 min，理論塔板數分別為5 854.130、7 186.004。結果見圖2～圖3。

圖2 檸檬苦素、諾米林對照品溶液的HPLC圖Figure 2 HPLC Chromatogram of limonin and nomilin reference substances

圖3 橘核藥材的HPLC圖Figure 3 HPLC chromatogram of C.reticulata

2.5.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取檸檬苦素、諾米林對照品9.70、9.80 mg，分別置于10 mL量瓶中，用色譜級甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。再分別精密吸取上述2種對照品儲備液2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用色譜級甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得檸檬苦素、諾米林質量濃度分別為0.194、0.196 mg/mL的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取橘核粉末(過3號篩)約0.5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加30 mL石油醚(60～90℃)于70℃水浴回流脫脂4 h，濾過。殘渣揮干石油醚，加入二氯甲烷50 mL 于50℃水浴回流提取1 h，濾過，濾液置于蒸發皿中揮干，加色譜級甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.5.4 線性關系的考察 分別取“2.5.2”項下混合對照品溶液適量，分別精密吸取2、5、7、10、12、14、16、20 μL，分別按“2.5.1”項下條件測定，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標分別作線性回歸，得回歸方程Y＝7.000 80×105X －6.028 6×103，r＝0.999 7和Y＝7.022 51×105X－3.292 9×103，r＝0.999 7。結果表明檸檬苦素在0.388～3.88 μg范圍內，諾米林在0.392～3.92 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，分別按“2.5.1”項下色譜條件連續測定6次，記錄檸檬苦素、諾米林的峰面積。計算得檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為0.56%、0.25%，結果表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩定性試驗 取橘核藥材粉末(第4批)約0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，分別按“2.5.1”項下色譜條件測定并記錄檸檬苦素、諾米林的峰面積。計算得檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為0.56%、1.97%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.7 重復性試驗 取同一批(第4批)橘核藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法分別制備供試品溶液，分別按“2.5.1”項下色譜條件測定并記錄檸檬苦素、諾米林的峰面積。計算得檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為1.87%、2.94%。

2.5.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取檸檬苦素、諾米林對照品適量，加甲醇制成檸檬苦素、諾米林質量濃度分別0.453 3、0.483 3 mg/mL的對照品溶液。精密稱取已知質量分數的橘核粉末0.25 g，共6份，精密稱定。分別精密加入上述混合對照品溶液3 mL，分別按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定。結果測得檸檬苦素的平均回收率為99.91%，RSD為1.47%；諾米林的平均回收率為100.86%，RSD為1.25%。見表2。

2.5.9 樣品的測定 分別取12批橘核藥材，分別按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.5.1”項下色譜條件測定，每批樣品平行操作2份，采用外標一點法進行質量分數測定，以干燥品計算，檸檬苦素和諾米林的質量分數結果見表3。

表2 橘核中檸檬苦素、諾米林的加樣回收率試驗結果Table 2 Recovery results of limonin and nomilin of C.reticulate (n＝6)

表3 12批橘核中檸檬苦素、諾米林的質量分數(以干燥品計)Table 3 Contents of limonin and nomilin of 12 batches of C.

由表3可知，橘核藥材干燥品中檸檬苦素和諾米林質量分數平均值分別為0.622%和0.586%，故暫規定橘核中檸檬苦素質量分數限度標準為不得少于0.49%、諾米林質量分數限度標準為不得少于0.46%。

3 討論

本研究考察了不同種類及比例的展開劑[環己烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(體積比4∶1∶5)、二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比7∶4)、二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比4∶1)]、不同點樣量、薄層板(自制硅膠H板、自制硅膠G板、硅膠G預制板)及不同溫度濕度的分離效果，結果表明本方法重復性較好。

2010年版《中國藥典》收錄的水分測定方法有甲苯法、烘干法、減壓干燥法及氣相色譜法。由于橘核中不含揮發油，故本試驗采用了烘干法。橘核是種子類藥材，藥材本身比較干凈，但在采收和運輸過程中可能引入泥土、砂石，故需要測定總灰分。浸出物測定中，分別以H2O、體積分數25%、50%、75%、95%乙醇為浸出溶劑，并以冷浸法、熱浸法為浸出條件進行試驗，比較試驗結果，最后確定橘核浸出物測定所用方法為熱浸法，浸出溶劑為95%乙醇。

橘核在1963年版《中國藥典》首次被收載，此后歷版藥典均有收載，但關于其質量標準，直至2010年版《中國藥典》也僅有來源、【性狀】、【鑒別】(僅有橫切面顯微鑒別)描述，鹽橘核僅有【炮制】的描述，并未收載橘核中有效成分的質量分數測定[1]356。本試驗采用高效液相色譜法同時測定橘核藥材中檸檬苦素和諾米林2個指標成分的質量分數，方法簡便、準確，可作為橘核質量的評價方法之一。

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(責任編輯:劉曉涵)

Optimization of Quality standard of Citrus reticulata Blanco Semen

HUANG Tianshan1，WANG Xiaoqing2，LUO Jiaqi1，WANG Shumei1，MENG Jiang1，YU Jiangyong3，LIANG Shengwang1

[1.School of Chinese Materia Medica/Key Laboratory of Digital Quality Evaluation Technique of Traditional Chinese Medicine(TCM)/State Administration of TCM/Guangdong Academies TCM Quality Engineering Technology Research Center，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou Shuqing Medical College，Zhengzhou 450000，China；3.Chinese Pharmacopoeia Commission，Beijing 100050，China]

ObjectiveTo optimize the quality standard and establish an HPLC fingerprint of Citrus reticulata Blanco Semen.MethodsThe moisture，ashes，and ethanol extracts of C.reticulata Blanco Semen were determined according to the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition，and the conditions of the TLC identification and HPLC were optimized.ResultsThe moisture in C.reticulata Blanco Semen was less than 7.0%，with the total ash within 5.0%.The 95%ethanol extract was not less than 34.0%by hot soak，and the contents of index components of limonin and nomilin were not less than 0.49%and 0.46%，respectively. The TLC identification spots were clear and easy to identify.ConclusionThe results might be used as important indicators for the quality standards of the C.reticulata Blanco Semen.

Citrus reticulata Blanco Semen；quality standard；TLC；HPLC

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.011

1006-8783(2015)05-0607-05

2015-07-08

國家中醫藥管理局中醫藥行業科研專項(201207004-7)

黃天山(1988—)，2013級碩士研究生，Email:164973531＠qq.com；通信作者:梁生旺(1954—)，教授，從事中藥質量控制研究，電話:020-39352172，Email:swliang371＠163.com。

時間:2015-09-30 15:33

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150930.1533.006.html