主動脈弓縮窄大鼠心功能代償期和失代償期的評價

陳潔娣，唐羽欣，胡婷婷，劉曉雨，譚文

(華南理工大學生物科學與工程學院/生物醫藥前孵化器研究中心/廣東省發酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

主動脈弓縮窄大鼠心功能代償期和失代償期的評價

陳潔娣，唐羽欣，胡婷婷，劉曉雨，譚文

(華南理工大學生物科學與工程學院/生物醫藥前孵化器研究中心/廣東省發酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

目的應用壓力容積導管系統評價主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)大鼠在不同階段心功能的變化。方法24只雄性Wistar大鼠，隨機分為TAC 3周組、TAC 9周組及假手術組(每組8 只)。麻醉后用Millar壓力容積導管檢測心功能改變。取心臟稱重并計算心臟質量/體質量比。結果與假手術組比較，TAC 3周大鼠的心臟質量/體質量比顯著增加；心功能無明顯改變。TAC 9周大鼠心臟質量/體質量比顯著增加；心功能顯著減弱，射血分數、每搏輸出量、每搏功、心輸出量顯著降低；左心室收縮、舒張末容積和等容舒張時間常數顯著增加。結論雄性Wistar大鼠TAC 3周后處于心肌肥厚代償期，TAC 9周后，處于心肌肥厚失代償期。

主動脈弓縮窄；心肌肥厚；心功能

主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)引起心肌肥厚進而導致心衰，TAC是研究壓力超負荷引起心肌重構和心衰常用的動物模型之一。但不同的動物，甚至同一種動物不同種系(大鼠)在實施TAC手術后，其心功能的改變不盡相同，比如代償期和失代償期的出現時間[1-2]，造成相應疾病過程和藥物作用的評價困難。目前國內外文獻用來研究心肌重構和心衰的TAC模型時間為2～9周不等，但對不同時間心功能的改變程度，比如代償期和失代償期并沒有明確的評價和界定，這對心肌重構或心功能損傷的相關病理及藥物作用研究帶來不確定因素。本文采用Wistar大鼠進行TAC手術，并應用壓力容積導管對不同時間的TAC大鼠進行心功能評價，明確心肌肥厚心功能代償期和失代償期的出現時間，為相關的病理藥理研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠，8～10周齡，體質量(200±20)g。購于中山大學動物實驗中心，生產許可證號:SCXK(粵)2011-0029。

1.2 主要儀器

外科手術設備(廣州器化醫療設備有限公司)；小動物呼吸機(Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA)；PLS-20A恒溫加熱墊(廣州飛迪生物科技有限公司)；PowerLab數據采集分析系統(AD InstrumentsInc.)；SPR-838 Millar導管 (Millar Instruments Inc.)；F-150S光纖冷光源、ASC-30小動物電子秤(永康市華鷹衡器有限公司)。

1.3 主要試劑

戊巴比妥鈉(德國Merck，規格:5 g/瓶)

1.4 大鼠心肌肥厚模型制作及分組

大鼠稱質量后腹腔注射3%(φ)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)。麻醉后，固定于手術臺上(恒溫墊控溫37℃)。行氣管插管，潮氣量為4～6 mL/200 g，呼吸頻率為70次/min。手術區域備皮消毒，從左胸部位把皮剪開，鈍性分離胸大肌和胸小肌，暴露出肋骨。在第2～3肋間無菌操作下開胸，分開胸腺，暴露主動脈弓。把4-0的醫用真絲編織線從右無名動脈和左頸總動脈之間穿過胸主動脈，將主動脈結扎于21G(外徑為0.8 mm)的針頭上，隨后把針頭抽出。結扎牢固后，將胸腺回位。逐層關胸，繼續通氣15 min，待大鼠恢復自主呼吸，拔出氣管插管，放回籠子飼養。假手術組，不結扎主動脈弓以外，其他步驟與模型組相同。大鼠隨機分為3組:假手術組，TAC 3周組，TAC 9周組，每組各8只。

1.5 心功能測定

原理:Millar導管的末端帶有1個壓力感受器和4個環狀電極。通過壓力感受器檢測心室壓力的變化。通過檢測心室內血液的電導，轉換為心室容積，轉化公式:Volume＝(1/α)?ρ?L2?G，Volume表示心室容積，α表示容積校正系數，ρ表示血液的電阻，L表示導管上干預電極之間的距離，G表示檢測的總電導。由于Millar導管檢測心室內血液的電導以電勢信號輸出，需要進行單位轉換。將相對容積電導信號(以電勢 V表示)轉化為絕對容積(μL)。此外，由于檢測的總電導其實包含了血液，心室壁和周圍的組織產生的電導，所以為了準確得到心室容積，需要進行高滲鹽水定標，以扣除心室壁和周圍組織產生的電導[3]。

1.5.1 Millar導管相對容積電導信號向絕對容積轉化 往絕緣校準器中5個已知容積的孔加入肝素抗凝的新鮮大鼠血液。將Millar導管插入孔中，保證4個電極均浸沒在血液中，保持10～20 s。記錄各孔血液產生的電導信號，重復2次。根據每孔測得的實際電導信號(以電勢V表示)與標示的容積擬合校正標準曲線，由此得到線性方程的斜率和截距(圖1)。將斜率和截距代入方程即可將相對容積電導信號向絕對體積轉化[4]。

圖1 相對容積向絕對容積校準標準曲線Figure 1 Standard calibration curve of relative volume to absolute volume

1.5.2 左心室內插入Millar導管 3周和9周后，將大鼠麻醉固定于手術臺上(控溫37℃)。行氣管插管，通上呼吸機，具體步驟參考模型[5]制備。頸部備皮消毒，行頸正中切口，鈍性分離皮下組織和頸前正中肌肉，找到右頸動脈。結扎右頸動脈遠心端，用動脈夾夾閉近心端。在近心端剪一小口，插入

Millar導管，扎1個松結，松開動脈夾，往左心室方向遞送Millar導管。適度調整Millar導管在左心室內的位置，直到出現穩定且漂亮的壓力-容量環。平穩10～15 min后，關上呼吸機，記錄停呼吸機5 s的數據(停呼吸機是為了避免肺部運動對數據測定的影響)，然后繼續通上呼吸機，重復此操作，采集5～8次停呼吸機5 s的數據。采集完穩定期的數據(負荷依賴性數據)后，對大鼠腹部進行備皮，然后開腹，在胸腔與腹腔之間的隔膜下找到下腔靜脈，用棉棒輕輕地把下腔靜脈壓住，記錄減少心臟前負荷的數據(非負荷依賴性數據)[6]。

1.5.3 平行容積(parallel volume，Vp)校正 經右頸靜脈注射約40 μL 30%的高滲鹽水，等容量恢復到給高滲鹽水前的水平，再次推進高滲鹽水，重復2～3次。選取心室容量增加但壓力沒明顯變化的一段數據(圖2)，得到給高滲鹽水后左心室舒張末-收縮末容積的線性關系，此直線與當左心室舒張末容積和收縮末容積相等時的直線(表示心室沒有血液)相交于一點，此點對應的容積為Vp(圖3)。最終表示左心室的容積要減去Vp值[3]。

圖2 注射高滲鹽水后壓力-容積環的變化Figure 2 Changes of pressure-volume loop after injection of hypertonic saline

圖3 Vp的推導過程Figure 3 Derivation process of the Vp

1.6 各組大鼠心臟實際質量及HE染色

進行心功能測定前，對大鼠稱質量，記錄各組大鼠體質量。測完心功能后，打過量麻藥處死大鼠，迅速開胸，剪下心臟，放入冰凍的生理鹽水中，洗凈血液，剪去心臟多余的組織，用濾紙吸干水分，電子天平稱取心臟的實際質量。并計算心臟質量/體質量比。心肌組織用10%(φ)中性甲醛溶液固定，制作石蠟切片后進行HE染色，普通光鏡下(400×)觀察心肌組織的形態學變化。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠的心臟質量、體質量和心臟質量/體質量比

與假手術組比較，TAC 3周組大鼠的心臟質量、體質量和心臟質量/體質量比增加(圖4)，說明3周后，模型組大鼠心肌肥大，造模成功；TAC 9周組大鼠的心臟質量、心臟質量/體質量比增加，與TAC 3周組比較，TAC 9周組大鼠的心臟質量/體質量比降低(圖4)，這是由于TAC 9周組大鼠心臟質量增加的同時體質量也顯著增加。

圖4 3周和9周造模后各組大鼠的心臟質量/體質量、心臟質量、體質量比較Figure 4 Comporison of heart weight/body weight ratio，heart weight and body weight in each group after 3 and 9 weeks surgery

2.2 各組大鼠的心功能參數

2.2.1 負荷依賴性的心功能參數 與假手術組比較，TAC 3周組大鼠的壓力-容量環向右移動，說明心室容量增加，心室擴張，但心室壓力沒有明顯變化，心功能處于良好狀態；TAC 9周組大鼠的壓力-容量環進一步向右移動，說明心室容量進一步增加，心室擴張，并且壓力-容量環向下移動，大鼠的收縮末壓力降低(圖5)。

圖5 穩定狀態下檢測的壓力-容積環Figure 5 Pressure-volume loop detected in steady state

與假手術組比較，TAC 3周組大鼠的射血分數(EF)降低；每搏輸出量(SV)、每搏功(SW)和心輸出量(CO)代償性增加；左心室收縮末容量(Ves)和舒張末容量(Ved)增加；等容舒張時間常數(Tau)差異無統計學意義，說明3周后，模型組大鼠心室擴張但心功能沒明顯變化；與假手術組比較，TAC 9周組的EF、SW顯著降低(表1)，說明9周后，模型組大鼠心臟收縮功能減弱；Ves和Ved顯著增加，說明9周后，模型組大鼠心室擴張；Tau顯著增加，說明9周后，模型組大鼠心臟舒張功能減弱。與TAC 3周組比較，TAC 9周組的EF、SV、SW顯著降低，Ves顯著增加(表1)，說明TAC后大鼠心功能隨時間推移而逐漸下降，模型組大鼠心臟收縮功能惡化，泵血能力降低，導致收縮末殘留在心室內的血液增加，由代償期進入失代償期。

2.2.2 非負荷依賴性的心功能參數 不同負荷狀態下的壓力-容積環，其收縮末點和舒張末點具有一定線性關系，即，收縮末壓力-容量關系(end-systolic pressure-volume relationship，ESPVR)和舒張末壓力-容量關系(end-diastolic pressure-volume relationship，EDPVR)，可分別反映心肌收縮性和被動舒張能力，且不受負荷的影響。ESPVR的斜率越高，說明心肌收縮能力越好；而EDPVR的斜率越低，說明心肌被動舒張能力越好。與假手術組比較，TAC 3周組的ESPVR和EDPVR的斜率增加，說明3周時，模型組大鼠心臟收縮力代償性增加的同時心臟被動舒張能力降低；TAC 9周組的ESPVR的斜率降低，EDPVR的斜率增加，說明9周時，模型組大鼠心臟收縮、舒張功能降低(圖6)。

表1 造模后3周和9周各組大鼠的心功能參數Table 1 Cardiac function parameters in each group after 3 and 9 weeks surgery(±s，n＝5)

表1 造模后3周和9周各組大鼠的心功能參數Table 1 Cardiac function parameters in each group after 3 and 9 weeks surgery(±s，n＝5)

與假手術組比較:?P＜0.05，??P＜0.01；與TAC 3周組比較:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別 EF/% SV/μL SW/(mmHg·μL－1)CO/(μL·min－1) Ves/μL Ved/μL Tau/ms假手術組 67.09±3.25 122.84±5.55 12 236.4±907.11 54 548.0±3 641.85 96.06±4.78 176.42±10.45 9.41±1.13 TAC 3周組 59.29±3.808 136.66±19.87 16 290.0±3 076.65 55 662.5±920 1.73 110.74±21.63 215.20±33.79 13.49±1.926 TAC 9周組 40.002±3.565??＃＃100.56±7.74＃6 096.0±837.7?＃＃38 314.0±3 584.91 204.92±16.48??＃＃243.72±12.33?16.31±0.853??

圖6 改變前負荷狀態下檢測的壓力-容積環Figure 6 Pressure-volume loop detected in the change of pre-load state

2.3 大鼠TAC 3周和9周后模型組、假手術組的心肌HE染色結果

與假手術組比較，TAC 3周組和TAC 9周組大鼠的心肌細胞大于假手術組。見圖7。

圖7 假手術組、TAC 3周組和TAC 9周組心肌HE染色結果比較(400×)Figure 7 Histological sections of hearts in the sham，3-weekTAC and 9-week TAC groups(400×)

3 討論

病理性心肌肥厚常常伴發心功能不全。在發病的初始階段，肥厚的心肌細胞收縮和舒張時間延長，速度減慢，但仍保持良好的肌纖維縮短能力和心室排空能力，因此，如果心臟有適當的室壁厚度足以克服室壁應力時，心功能仍保持在良好的狀態，即為心肌肥厚的代償性階段；隨著時間的推移，當心臟的室壁厚度不足以克服室壁應力時，心室會發生進行性擴大并伴隨著心功能的減弱，即為心肌肥厚的失代償階段，并最終發展為心衰。

目前，評價心肌肥厚模型是否造模成功常用的指標包括心臟大體形態的評價(心臟質量、左心室質量、心腔大小改變、心肌壁厚度改變)；心肌細胞大小評價(病理組織染色評價細胞橫截面積、直徑)[7-8]。本實驗對成年雄性Wistar大鼠行主動脈弓縮窄制備心肌肥厚的動物模型。造模第3周和第9周后顯示:TAC模型組大鼠的心臟質量、心臟質量/體質量比均顯著增加，說明造模成功。

心功能檢測的方法有超聲波心動掃描記術、磁共振成像等。這些方法均是無創性的檢測心功能，但具有一定的局限性，一方面監測心室功能時，會受到心室壁厚度和心室復雜幾何形狀的影響；另一方面心室負荷的顯著變化會影響監測的結果。因此不能準確地判斷心臟的收縮功能變化是由于心肌本身的收縮性改變，還是前、后負荷改變而引起的[9]。壓力容積導管操作復雜，有一定的創傷，但其對心功能的評價更為準確、可靠，可以全面地對心功能作出評價。還可通過人為改變前后負荷，在一定的變化范圍內對心功能做出動態評價，從而更為全面地研究疾病的病變機制和藥物的作用。大量的研究表明[10-12]，心室壓力容積導管能同時分析負荷調節和非負荷調節的心功能指標。通過對心臟負荷進行干預，記錄不同負荷下的壓力-容積環是獲得ESPVR 和EDPVR傳統的、直接的方法，且不受負荷的影響。

本研究通過壓力容積導管技術評價TAC造模后各組大鼠的心功能變化，分別在穩定狀態下及壓迫下腔靜脈的狀態下檢測負荷調節和非負荷調節的心功能指標。結果表明，與假手術組比較，TAC 3周組的收縮功能指標EF、SV、SW、CO和舒張功能指標Tau均無明顯變化，說明TAC 3周后，大鼠心臟的收縮和舒張功能無明顯變化，此時，大鼠處于心肌肥厚的代償期。與假手術組比較，TAC 9周組的EF、SV、SW、CO均顯著降低，Tau顯著增加，說明TAC 9周后大鼠心臟的收縮功能和舒張功能均降低，此時，大鼠處于心肌肥厚失代償期。

左心室收縮末容積(Ves)和舒張末容積(Ved)反映心室容積大小，其數值的變化預示心臟功能的變化。本研究表明，TAC 3周組的Ves和Ved均大于假手術組，但差異不顯著，說明TAC 3周后引起大鼠心室擴張，但心功能變化不顯著。TAC 9周組的Ves和Ved均顯著大于假手術組，說明TAC 9周后引起大鼠心室進一步擴張，并且心臟的收縮力降低，使得殘留在心室內的血量增多，Ves增大。此外，Ved的增加會導致心室舒張末壓力增加，即心臟的前負荷增加。

ESPVR和EDPVR的斜率能準確地反映心臟的收縮和舒張功能，且不受負荷的影響。ESPVR的斜率反映心肌收縮性，其值越大，心肌收縮力越強，反之，收縮力降低；EDPVR的斜率反映心肌被動舒張特性，其值越大，心肌僵硬度增加，順應性下降。本研究表明，TAC 3周組的ESPVR和EDPVR的斜率均增加，而 TAC 9周組的 ESPVR的斜率降低，EDPVR的斜率增加，說明TAC 3周后，大鼠心臟的收縮功能代償性增加但舒張功能降低；TAC 9周后，大鼠心臟的收縮功能和舒張功能均降低，這與負荷調節的心功能指標結果一致。

綜上所述，TAC誘導大鼠發生心肌肥厚，在壓力超負荷初期，心臟增大的同時心肌收縮力代償性增加。隨著病情發展，心臟增重，但是心臟的收縮、舒張功能惡化，出現失代償癥狀。雄性Wistar大鼠TAC 3周，適用于心肌重構相關疾病研究，TAC 9周，適用于心力衰竭相關疾病研究。

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(責任編輯:王昌棟)

Evaluation of cardiac function in compensatory and decompensatory states in
transeverse aortic constriction rats

CHEN Jiedi，TANG Yuxin，HU Tingting，LIU Xiaoyu，TAN Wen
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo evaluate changes in heart weight and cardiac function in transverse aortic constriction(TAC)rats using the pressure-volume catheter system.MethodsTwenty-four male Wistar rats were randomly divided into the TAC 3-week group，the TAC 9-week group and the sham group(n＝8 for each group).After anesthesia，cardiac function was studied by Millar pressure volume catheter.Hearts were weighted and heart weight/body weight ratio was calculated.ResultsCompared with the sham group，the ratio of heart weight to body weight was increased in the TAC 3-week group，but the cardiac function did not obviously changed.The ratio of heart weight to body weight was also increased in the TAC 9-week group and the cardiac function was significantly reduced.Ejection fraction，stroke volume，stroke work and cardiac output were reduced.Left ventricular end-systolic or diastolic volume and the time constant of isovolumic relaxation increased.ConclusionMale Wistar rats are in myocardial hypertrophy compensatory and decompensatory states after TAC 3 weeks and 9 weeks，respectively.

transverse aortic constriction；myocardial hypertrophy；cardiac function

R543.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.025

1006-8783(2015)05-0670-06

2015-05-21

廣東省重大科技專項(2012A080204001)；廣州市重大專項科技項目(201300000051)

陳潔娣(1988—)，女，2012級碩士研究生，Email:jdchen510＠163.com；通信作者:譚文，男，教授，主要從事醫藥生物學研究，Email:went＠scut.edu.cn。

時間:2015-09-12 10:07

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150912.1007.002.html