煙草WRKY—R1基因的克隆及瞬時表達分析

胡曼+宋丹丹+楊金淼+劉衛群

摘要：以煙草根尖組織cDNA為模板，RT-PCR結合電子克隆得到NtWRKY-R1基因的完整ORF，序列分析顯示，NtWRKY-R1具有WRKY轉錄因子家族典型的WRKYGQK保守結構域及C2H2的鋅指結構，屬于WRKY轉錄因子家族第Ⅱ類。采用生物信息學方法對NtWRKY-R1蛋白的理化性質、進化關系和磷酸化位點進行預測和分析，結果表明，NtWRKY-R1與茄科植物保守結構域的同源性及系統進化關系最近；磷酸化位點分析顯示該蛋白可能通過磷酸化作用修飾，進而對其相應的代謝活動進行調節。通過構建真核表達載體、建立瞬時表達分析體系，結果顯示，NtWRKY-R1基因的過表達導致JA信號途徑標記基因PDF1.2及煙堿合成關鍵酶基因PMT1表達量降低，推測NtWRKY-R1基因影響JA信號途徑，進而調控煙堿合成。

關鍵詞：煙草； NtWRKY-R1；基因克隆；生物信息學分析；瞬時表達分析；信號途徑

中圖分類號：S572.035.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0012-06

WRKY是植物中最大的轉錄因子家族之一，因含有7個氨基酸組成的高度保守的WRKYGQK序列而得名。研究發現WRKY類轉錄因子廣泛參與植物生物[1～3]、非生物[4，5]脅迫應答，植物衰老[1]和器官發育[6]等一系列生理活動。目前，有關WRKY轉錄因子的研究已取得很大進展，但主要集中在基因克隆、表達及通過功能缺陷或超表達研究其功能，對其介導的植物應答反應過程、逆境脅迫下的反應調控機制等仍然不清楚。

煙株打頂是一項重要的農藝措施，打頂后，煙草葉中的煙堿合成量增加。有研究表明，打頂可誘發煙堿生物合成增加是煙株響應傷害信號和激素水平改變等綜合效應的結果。機械傷害誘導第二信使茉莉酸（JA）產生，JA信號途徑誘導煙堿合成關鍵酶腐胺N-甲基轉移酶（PMT）和鳥氨酸脫羧酶（ODC）基因轉錄水平升高，促進煙堿的生物合成[12]。本課題組從煙草打頂前、后根尖組織消減抑制雜交（SSH）cDNA文庫中篩選出一條wrky-like的EST（HO059652）序列[7]，采用電子克隆結合RT-PCR的方法克隆到該基因，并對其進行了生物信息學及瞬時表達分析，為探討煙株打頂后煙堿合成能力增加的調控機制及該轉錄因子在地上部傷害刺激誘導根系次生代謝產物積累的分子機制奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1植物材料供試煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.cv. K326）。

1.1.2菌株、載體與主要試劑大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和植物表達載體pROK2由本實驗室保存；TRIzol、MLV、pMDTM19-T Vector、纖維素酶等購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取及反轉錄選取生長5～6周的實驗室栽培煙草K326植株，TRIzol法提取煙草根尖組織總RNA，反轉錄為cDNA，提取和反轉錄方法均參照試劑說明書。

1.2.2NtWRKY-R1基因的電子克隆以本實驗室構建的煙草打頂前、后的SSH cDNA文庫中篩選出的一條WRKY類轉錄因子EST序列（HO059652）為查詢探針，在煙草的EST數據庫中進行查詢搜索，最后拼接得到一條含有完整ORF的cDNA序列。以此序列設計特異引物，以煙草根尖組織cDNA為模板，進行PCR擴增。引物序列F：5′-GCTAGGATCCCATGGATGGAAGATTCAAT-3′（劃線處為BamHⅠ酶切位點）；R： 5′-TAGGTACCTCAGCCCGTGGTCCCACAC-3′（劃線處為KpnⅠ酶切位點）。擴增產物連接至pMDTM 19-T Vector，轉化大腸桿菌DH5α，鑒定并測序。

1.2.3NtWRKY-R1的生物信息學分析從NCBI數據庫中BLAST得到擬南芥（AAS79556）、辣椒（AAZ99027）、馬鈴薯（ABU49724）、大豆（ABS18444）、蓖麻（XP_002522247）、棉花（ACD56629）、小麥（ABO15543）、水稻（DAA05131）的WRKY氨基酸序列。

依據MEGA 4.1軟件對所獲得氨基酸序列的保守結構域與NtWRKY-R1的保守結構域進行同源性比對和聚類分析；NtWRKY-R1蛋白的理化性質、磷酸化修飾和親水性/疏水性分析分別用ProtParam、NetPhos 2.0 Server和ProtScale分析，蛋白二級結構的預測用Scansite、SOPMA在線工具完成。

1.2.4NtWRKY-R1瞬時表達載體的構建用BamHⅠ和KpnⅠ同時雙酶切質粒pROK2和pMDTM19-T-NtWRKY-R1，回收目的片段；用T4 DNA連接酶16℃、過夜連接，然后轉化大腸桿菌DH5α，構建融合質粒pROK2-NtWRKY-R1。熱激法將此融合質粒和空載體分別轉化農桿菌GV3101感受態，Kan抗性篩選和菌液PCR驗證陽性克隆子。

1.2.5瞬時表達分析參照Sheen lab給出的原生質體制備和PEG介導原生質體轉化[13]的方法制備并轉化煙草原生質體，作為對照的原生質體、原生質體與兩種質粒的混合液分別置于光照培養箱中，孵育6～18 h，用布氏漏斗和真空泵盡可能多地除去細胞中培養基，TRIzol法提取RNA，Primer 5.0設計特異性引物，半定量RT-PCR檢測PDF1.2、PMT1和NtWRKY-R1基因的瞬時表達水平。PDF1.2引物為PDF1.2-F：5′-GCGCCACACAACACATACATCTATACATTG-3′，PDF1.2-R：5′-GCGCCGGTATTTTTATATTATTGTAACAACAA-3′；PMT1引物為PMT1-F：5′-GCCCTGAACACCTCAACGGCTAC-3′，PMT1-R：5′-GCGTTCGATTGAAGGATAACGAAGCATT-3′；以Actin基因為內參，引物為Actin-F：5′-ATGGCGGATGGGGAGGACAT-3′，Actin-R：5′-TTAGAAGCATTTGCGGTG-3′。endprint

2結果與分析

2.1NtWRKY-R1基因的克隆及序列分析

表明，NtWRKY-R1基因ORF全長915 bp，編碼304個氨基酸，編碼蛋白具有WRKY轉錄因子家族典型的保守結構域和高度保守的7個氨基酸殘基WRKYGQK（圖2）。

2.2NtWRKY-R1蛋白的生物信息學分析

2.2.1不同WRKY蛋白的同源性比對及進化分析通過同源性比對（圖3）發現不同物種來源的WRKY之間有高度的同源性，并且NtWRKY-R1與茄科植物保守結構域的同源性均達到85%。系統進化分析（圖4）顯示，NtWRKY-R1蛋白與茄科植物聚類在一起，而與其它非茄科植物距離較遠。

2.2.2NtWRKY-R1蛋白的理化性質分析NtWRKY-R1蛋白含有304個氨基酸，分子量為34.21 kD，等電點為5.69，在酸性范圍內，屬親水蛋白。

2.2.3NtWRKY-R1蛋白二級結構預測用SOPMA預測NtWRKY-R1蛋白的二級結構（圖5），結果顯示，α-螺旋占21.71%；β-折疊為9.87%；β-轉角最少，僅為3.62%；其余為無規則卷曲。這些二級結構構成NtWRKY-R1的基本結構。

2.2.4NtWRKY-R1蛋白磷酸化位點分析利用NetPhos 2.0 Server 在線分析NtWRKY-R1蛋白的磷酸化位點，結果（圖6）表明，該蛋白共有22個磷酸化位點，其中18個絲氨酸位點，4個蘇氨酸位點。

2.3NtWRKY-R1瞬時表達載體構建及農桿菌轉化

BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定融合載體pROK2-NtWRKY-R1，獲得大小約915 bp條帶（圖7），證實重組子含有目的基因，經測序驗證結果正確。菌液PCR驗證轉化農桿菌GV3101菌落（圖8），PCR產物大小約915 bp，證明轉化成功。

2.4煙草原生質體制備及NtWRKY-R1基因瞬時表達分析

在光學顯微鏡下觀察制備好的原生質體（圖9），煙草葉片酶解去除細胞壁后呈圓球形，細胞膜周圍分布有綠色的葉綠體，中間透明的為中央大液泡，少許雜質為降解的細胞壁及胞間組織。

PDF1.2、PMT1、NtWRKY-R1基因瞬時表達情況見圖10。PDF1.2是響應JA信號的關鍵基因，PMT1是煙堿合成關鍵酶PMT基因家族的代表，NtWRKY-R1的表達量增加而PDF1.2的表達量下降，說明NtWRKY-R1能夠影響煙草JA信號途徑的響應。同時PMT1的表達量下降，表明NtWRKY-R1能夠負調控PMT1基因的表達，抑制煙堿的生物合成。

1：對照，即未經轉化的原生質體；2：轉化空載體pROK2的原生質體；3：轉化pROK2-NtWRKY-R1過表達載體的原生質體

3結論與討論

通過電子克隆結合RT-PCR方法克隆煙草根尖組織獲得NtWRKY-R1基因，序列分析顯示其N端具有典型WRKYGQK保守結構域，C端有鋅指類似結構，表明從煙草根尖組織中克隆得到了典型的WRKY轉錄因子基因。應用生物信息學的方法分析，NtWRKY-R1在進化關系上與茄科植物最近。有研究發現WRKY蛋白可能處于MAP激酶（MAPK）的下游，其功能受MAPK的修飾。Shen等[9]發現，水稻OsWRKY30與OsMPK3在體外、體內都可以直接互作，且OsWRKY30可被OsMPK3、OsMPK7和OsMPK14體外磷酸化，說明OsWRKY30是水稻MPKs途徑中重要的底物。Erik等[8]發現擬南芥MAPK4可激活AtWRKY25和AtWRKY33，且MAPK4能在體外磷酸化這兩個蛋白。此外，也有研究證明煙草MAPK或參與調節WRKY的活性[10，11]。NtWRKY-R1轉錄因子磷酸化位點的分析顯示，其多肽序列中有22個磷酸化位點，說明該蛋白響應地上部傷害刺激的過程可能是一個磷酸化的過程，進而對其相應的代謝活動進行調節。

前人研究表明，煙堿合成主要受關鍵酶ODC、PMT、QPT、MPO、A622調控，而JA可以調控PMT基因（NsPMT）和MPO基因的啟動子區，進而控制其表達，因此，JA是煙堿生物合成過程中關鍵的激素調控因子[14]，且該信號途徑激活之后會誘導防御基因PR4、Thi2.1和PDF1.2的表達等[15]。瞬時表達NtWRKY-R1的試驗結果顯示，NtWRKY-R1的過表達導致JA信號途徑關鍵防御基因PDF1.2和煙堿合成關鍵酶基因PMT1的表達下調。結合前人的研究，推測NtWRKY-R1抑制了JA信號途徑，而JA又通過調控PMT的啟動子區域進而影響PMT基因的表達。說明，JA與NtWRKY-R1的表達呈負相關，而與PMT的表達有正相關關系。這為我們進一步研究NtWRKY-R1參與煙堿合成的分子機制奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Robatzek S， Somssich I E. Targets of AtWRKY6 regulation during plant senescence and pathogen defense[J]. Genes Dev.，2002，16（9）： 1139-1149.

[2]Chujo T， Kato T， Yamada K， et al. Characterization of an elicitor-induced rice WRKY gene， OsWRKY71[J].Biosci. Biotechnol. Biochem.，2008， 72（1）：240-245.

[3]Dong J， Chen C H， Chen Z X. Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response[J]. Plant Mol. Biol.，2003， 51：21-37.endprint

[4]Chen L， Song Y， Li S， et al. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1819（2）：120-128.

[5]Ramamoorthy R， Jiang S， Kumar N， et al. A comprehensive transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments[J]. Plant Cell Physiol.，2008，49（6）： 865-879.

[6]Alexandrova K S， Conger B V. Isolation of two somatic embryogenesis-related genes from orchardgrass （Dactylis glomerata）[J]. Plant Sci.，2002， 162：301-307.

[7]戚元成，馬雷，王菲菲，等.打頂煙草根尖組織抑制性消減cDNA文庫的構建及其序列分析[J].中國農業科學，2011，44（7）：1331-1337.

[8]Andreasson E， Jenkins T， Brodersen P， et al. The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses[J]. The EMBO Journal，2005， 24： 2579-2589.

[9]Shen H， Liu C， Zhang Y， et al. OsWRKY30 is activated by MPK kinases to confer drought tolerance in rice[J]. Plant Mol. Biol.，2012， 80（3）： 241-253.

[10]Kim C Y， Zhang S. Activation of a mitogen-activated protein kinase cascade induces WRKY family of transcription factors and defense genes in tobacco[J].Plant J.，2004， 38：142-151.

[11]Yang P， Wang Z， Fan B， et al. A pathogen-and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding activity recognizes the elicitor response element of the tobacco class I chitinase gene promoter[J].Plant J.，1999，18（2）：141-149.

[12]Todd A T， Liu E， Polvi S L， et al. A functional genomics screen identifies diverse transcription factors that regulate alkaloid biosynthesis in Nicotiana benthamiana[J]. Plant J.， 2010， 62： 589-600.

[13]王幼平， 吳曉霞. PEG介導的原生質體融合方法的改進及注意事項[J].生物學通報， 2009，44（1）：51.

[14]Fukaki H， Okushima Y O， Takasa M. Auxin-mediated lateral root formation in higher plant[J]. International Review of Cytology，2007， 256： 111-137.

[15]Liechti R， Farmer E E. The jasmonate pathway[J].Science，2002，296：1649-1650.endprint

[4]Chen L， Song Y， Li S， et al. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1819（2）：120-128.

[5]Ramamoorthy R， Jiang S， Kumar N， et al. A comprehensive transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments[J]. Plant Cell Physiol.，2008，49（6）： 865-879.

[6]Alexandrova K S， Conger B V. Isolation of two somatic embryogenesis-related genes from orchardgrass （Dactylis glomerata）[J]. Plant Sci.，2002， 162：301-307.

[7]戚元成，馬雷，王菲菲，等.打頂煙草根尖組織抑制性消減cDNA文庫的構建及其序列分析[J].中國農業科學，2011，44（7）：1331-1337.

[8]Andreasson E， Jenkins T， Brodersen P， et al. The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses[J]. The EMBO Journal，2005， 24： 2579-2589.

[9]Shen H， Liu C， Zhang Y， et al. OsWRKY30 is activated by MPK kinases to confer drought tolerance in rice[J]. Plant Mol. Biol.，2012， 80（3）： 241-253.

[10]Kim C Y， Zhang S. Activation of a mitogen-activated protein kinase cascade induces WRKY family of transcription factors and defense genes in tobacco[J].Plant J.，2004， 38：142-151.

[11]Yang P， Wang Z， Fan B， et al. A pathogen-and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding activity recognizes the elicitor response element of the tobacco class I chitinase gene promoter[J].Plant J.，1999，18（2）：141-149.

[12]Todd A T， Liu E， Polvi S L， et al. A functional genomics screen identifies diverse transcription factors that regulate alkaloid biosynthesis in Nicotiana benthamiana[J]. Plant J.， 2010， 62： 589-600.

[13]王幼平， 吳曉霞. PEG介導的原生質體融合方法的改進及注意事項[J].生物學通報， 2009，44（1）：51.

[14]Fukaki H， Okushima Y O， Takasa M. Auxin-mediated lateral root formation in higher plant[J]. International Review of Cytology，2007， 256： 111-137.

[15]Liechti R， Farmer E E. The jasmonate pathway[J].Science，2002，296：1649-1650.endprint

[4]Chen L， Song Y， Li S， et al. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1819（2）：120-128.

[5]Ramamoorthy R， Jiang S， Kumar N， et al. A comprehensive transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments[J]. Plant Cell Physiol.，2008，49（6）： 865-879.

[6]Alexandrova K S， Conger B V. Isolation of two somatic embryogenesis-related genes from orchardgrass （Dactylis glomerata）[J]. Plant Sci.，2002， 162：301-307.

[7]戚元成，馬雷，王菲菲，等.打頂煙草根尖組織抑制性消減cDNA文庫的構建及其序列分析[J].中國農業科學，2011，44（7）：1331-1337.

[8]Andreasson E， Jenkins T， Brodersen P， et al. The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses[J]. The EMBO Journal，2005， 24： 2579-2589.

[9]Shen H， Liu C， Zhang Y， et al. OsWRKY30 is activated by MPK kinases to confer drought tolerance in rice[J]. Plant Mol. Biol.，2012， 80（3）： 241-253.

[10]Kim C Y， Zhang S. Activation of a mitogen-activated protein kinase cascade induces WRKY family of transcription factors and defense genes in tobacco[J].Plant J.，2004， 38：142-151.

[11]Yang P， Wang Z， Fan B， et al. A pathogen-and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding activity recognizes the elicitor response element of the tobacco class I chitinase gene promoter[J].Plant J.，1999，18（2）：141-149.

[12]Todd A T， Liu E， Polvi S L， et al. A functional genomics screen identifies diverse transcription factors that regulate alkaloid biosynthesis in Nicotiana benthamiana[J]. Plant J.， 2010， 62： 589-600.

[13]王幼平， 吳曉霞. PEG介導的原生質體融合方法的改進及注意事項[J].生物學通報， 2009，44（1）：51.

[14]Fukaki H， Okushima Y O， Takasa M. Auxin-mediated lateral root formation in higher plant[J]. International Review of Cytology，2007， 256： 111-137.

[15]Liechti R， Farmer E E. The jasmonate pathway[J].Science，2002，296：1649-1650.endprint