氮素對印楝愈傷組織和懸浮細胞培養的影響

韓廣建，李興林，別振宇，張國運

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

印楝(Azadirachta indica A.Juss)，楝科楝屬植物，生長于印巴次大陸，內含多種生物活性物質，其中，活性最強的是印楝素[1].印楝素，四環三萜類化合物，屬于檸檬苦素類物質，主要存在于印楝種仁中，具有廣泛的生物殺蟲效果.由于種仁的生產力有限，人們通過植物組織培養的技術對印楝素進行大規模生產.影響印楝組織培養的因素有很多[2-3]，比如碳素、氮素、激素、溶氧量等.

氮素對植物生理代謝和生長有重要作用.印楝細胞中氮素含量的多少及氮素的存在形式都直接影響著印楝組織的生長和代謝產物的積累.氮素主要以硝態氮(-N)和銨態氮(-N)的形式被植物直接吸收和利用[4-5].在印楝的組織培養研究中，Prakash 等[6]指出，僅以硝態氮為氮素時，培養物有較高的細胞生長(7.1,g/L)和印楝素積累(每克細胞1.76,mg，每升培養物12.49,mg)，而高銨態氮對細胞生長和印楝素形成有抑制作用.但是，同時以硝態氮和銨態氮為氮素時，有利于印楝素在胞內胞外積累的有效分配.Sujanya 等[7]研究表明，以MS 培養基[8]為基準，在其他成分及濃度相同條件下，當硝態氮與銨態氮的物質的量比為4∶1 時，印楝素從胞內幾乎完全轉移到了胞外.然而，作者對產生這種結果的機理沒有探討.眾所周知，可溶性蛋白是植物中酶的重要組成部分，其直接或間接影響著植物生長代謝活動，是重要的生理生化指標之一.基于此，本文旨在探討不同氮素對印楝愈傷組織和懸浮細胞培養的影響，主要通過考察細胞中生物量、可溶性蛋白、印楝素以及檸檬苦素類物質(AZRL)含量篩選最佳氮素，為利用細胞工程手段生產印楝素提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 印楝來源

印楝種子購于云南天宇種子公司，種植于天津科技大學泰達校區.印楝幼葉采摘于印楝種子萌發生長兩年后的幼株.

1.2 主要試劑及儀器

印楝素標準品，美國Sigma 公司；檸檬苦素標準品，上海純優生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白(BSA)標準品，上海索萊寶生物科技有限公司.

TDL-40B 型離心機，上海安亭科學儀器廠；TU-1810 型紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Agilent 1200 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司.

1.3 印楝愈傷組織的誘導

取幼嫩的葉片作為外植體，在流動自來水下沖洗3～5,h.然后將外植體移至無菌超凈臺上，用2%,的NaClO 浸泡消毒約10,min，無菌蒸餾水沖洗3 次，再用75%,酒精消毒3 次，每次30,s，并且每次酒精消毒后均用無菌蒸餾水沖洗3 次.繼之，用無菌濾紙將外植體(幼葉)表面上的水珠吸干凈，并將葉片的鋸齒狀邊緣部分以及葉柄去除，之后再切割成約1,cm2的小塊，分別轉接到含有蔗糖3%,、瓊脂0.65%,的MS[8]+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)、MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(1.99,g/L)、MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(3.98,g/L)固體培養基上，在(25±2)℃下進行黑暗培養[9].經20,d 后，分別將上述3 種愈傷組織在相應的培養基上進行繼代培養.

1.4 印楝細胞培養的建立

在氮素的物質的量比不同的培養基上，分別取第3 次繼代培養的淺黃松散愈傷組織適量，在無菌條件下切碎，稱取 5,g(以鮮質量計)，相應地轉接到100,mL 含有3%,蔗糖的MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)、MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(1.99,g/L)、MS+NAA1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(3.98,g/L)液體培養液中.然后在(25±2)℃、轉速125,r/min、光/暗周期8,h/16,h[7]的條件下進行振蕩培養.每隔12,d 繼代培養1 次，繼代培養接種量為30%,.

1.5 測定方法

1.5.1 印楝細胞生物量的測定

參考Raval 等[10]描述的生物量測定方法.將細胞懸浮液3,000,r/min 離心20,min，收集離心沉淀物，放入預稱量的鋁盤中稱質量，與接種量相比，二者之差即為細胞鮮質量.然后對鮮細胞進行60,℃干燥至質量恒定，即為細胞干質量.

1.5.2 可溶性蛋白含量的測定[11-12]

最大吸收波長掃描：精確稱取牛血清白蛋白(BSA)標準品0.020,0,g，用蒸餾水定容至100,mL，即得200,μg/mL 的BSA 標準溶液.然后分別量取BSA標準溶液 0.0、0.2、0.4、0.6,mL，用蒸餾水補充至1.0,mL，并加5,mL 的考馬斯亮藍G-250 溶液，充分混勻后靜置5,min，然后在400～600,nm 波長范圍內掃描.結果在590,nm 處呈現最大吸收峰.

可溶性蛋白含量標準曲線的確定：分別量取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL BSA 標準溶液于6 支10,mL 試管中，并用蒸餾水補充至1.0,mL.然后向各試管中加入5,mL 考馬斯亮藍G-250 溶液，混勻后靜置5,min，在590,nm 波長處測定其吸光度.以吸光度對可溶性蛋白含量做回歸處理，得到回歸方程y＝0.995,1,x+0.099,7，R2＝0.993,6.

樣品液的制備：稱取印楝組織或細胞鮮樣0.5,g，加入3,mL 磷酸緩沖液(PBS)和適量石英砂，冰浴研磨后移入10,mL 離心管中，再用5,mL pH 7.8 緩沖液沖洗，一并轉入10,mL 離心管中，于4,℃、12,000g離心15,min，收集上清液即為可溶性蛋白質提取液，4,℃冰箱保存備用.

樣品液中可溶性蛋白含量的測定：取上述提取液1.0,mL，加5,mL 的考馬斯亮藍G-250 溶液，在旋渦混合器上混合處理，靜置5,min，在590,nm 處測定吸光度.結合回歸方程和式(1)計算出鮮樣中可溶性蛋白質含量(mg/g).

式中：m1為查標準曲線所得的每管可溶性蛋白的質量，mg；V1為提取液總體積，mL；V2為測定所提取液體積，mL；m2為取樣量，g.

1.5.3 印楝素含量的測定[13]

印楝素標準曲線的確定：精確稱取印楝素標準品0.002,0,g，用色譜純甲醇定容至 10,mL，即得0.2,mg/mL 的印楝素標準溶液.然后分別量取印楝素標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL，用色譜純甲醇補充至1.0,mL，過膜(0.22,μm)后用高效液相色譜儀進行測定.以吸收峰面積對印楝素含量做回歸處理，得到回歸方程y＝1.611,x+62.231，R2＝0.991,3.依據回歸方程可計算樣品中印楝素的含量.

印楝素高效液相測定條件：固定相為C18 柱(250,mm×4.6,mm，45,℃)，流動相為甲醇與水(體積比為55∶45)，流量1.0,mL/min，檢測波長217,nm，出峰時間約為4.8,min.

樣品中印楝素含量的測定：稱取1.0,g(以干質量計)愈傷組織(或懸浮細胞)，浸泡于10,mL 甲醇中進行提取，并按體積比60∶40 的比例向甲醇提取液中添加無菌蒸餾水，然后用與甲醇提取液體積相同的二氯甲烷萃取15,min，萃取兩次，合并兩次萃取液，之后進行40,℃真空旋轉蒸發.旋轉蒸發后的產物用5,mL 色譜純甲醇重溶并過膜(0.22,μm)，運用高效液相色譜(HPLC)法進行印楝素含量測定.由回歸方程計算樣品溶液中印楝素的含量.

1.5.4 檸檬苦素含量的測定

檸檬苦素標準曲線的確定：精確稱取檸檬苦素標準品5.00,mg 置于50,mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容，即得0.1,mg/mL 的檸檬苦素標準溶液.分別量取0.0、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4,mL 標準溶液置于7 支10,mL 試管中，用二氯甲烷分別定容至1.4,mL；加入0.02,g/mL 香草醛甲醇溶液0.4,mL，混勻后室溫放置2,min；添加0.6,mL 濃硫酸，并迅速振蕩10,s，再加入1.4,mL 的甲醇溶液；靜置10,min 后于579,nm 處測定其吸光度.以吸光度對檸檬苦素含量做回歸處理，得到回歸方程 y＝2.696,5,x-0.120,4，R2＝0.993,0.依據回歸方程計算樣品中檸檬苦素的含量.

樣品中檸檬苦素含量的測定[14]：將印楝組織在40,℃下烘干至質量恒定；稱取樣品0.15,g(以干質量計)，浸泡于10,mL 甲醇中進行提取，并按體積比60∶40 的比例向甲醇提取液中添加無菌蒸餾水，然后用與甲醇提取液體積相同的二氯甲烷萃取15,min，萃取兩次，合并兩次萃取液，之后進行40,℃真空旋轉蒸發.旋轉蒸發后的產物用5,mL 二氯甲烷重溶，即得樣液.取1.4,mL 樣液于試管中，加入0.02,g/mL 香草醛甲醇溶液0.4,mL，混勻后室溫靜置2,min；然后加入 0.6,mL 濃硫酸，并迅速振蕩10,s；再加入1.4,mL 的甲醇溶液，以二氯甲烷作為空白對照，測定其吸光度.由回歸方程計算樣品溶液中檸檬苦素的含量.

1.5.5 數據處理

通過Excel 和SPSS 軟件對實驗數據進行統計檢驗和顯著性分析.

2 結果與討論

2.1 氮素對生物量的影響

硝態氮與銨態氮物質的量比對生物量的影響見表1.在3 種不同的硝態氮與銨態氮物質的量比下，印楝愈傷組織和懸浮細胞中的生物量均隨硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而增加，并在硝態氮與銨態氮物質的量比為4∶1 時達到最大，分別為35.85,g/L和92.13,g/L.硝態氮含量增加的同時培養系統中的氮素含量也增加，而氮素的增加有利于生物量的增加.這與Rodrigues 等[15]所報道高氮素增加了生物量的結果相同.

表1 硝態氮與銨態氮物質的量比對生物量的影響(n＝3)Tab.1 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on the biomass of Azadirachta indica A.Juss (n＝3)

同時，由表1 也可以看出：在3 種不同硝態氮與銨態氮物質的量比的情況下，懸浮細胞的生物量兩兩間有顯著性差異；但是愈傷組織的生物量，在硝態氮與銨態氮物質的量比為2∶1 和3∶1 時沒有顯著性差異.這可能是由于印楝細胞呈懸浮狀態時，有利于細胞對氧的吸收，有利于細胞的新陳代謝，從而有利于細胞的生長.溶氧量對細胞生物量的影響在多種文獻中[15-16]也有報道.

2.2 氮素對可溶性蛋白含量的影響

如表2 所示，在3 種不同的硝態氮與銨態氮物質的量比下，印楝愈傷組織中的可溶性蛋白含量隨硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而增加，在硝態氮與銨態氮物質的量比為4∶1 時達到最大(12.67,mg/g)，但在硝態氮與銨態氮物質的量比為3∶1 和4∶1 時，二者的可溶性蛋白含量幾乎相同，并沒有顯著性差異.

印楝懸浮細胞中的可溶性蛋白隨硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而先升高再降低，在硝態氮與銨態氮物質的量比為3∶1 時達到最大(10.18,mg/g).并且，在硝態氮與銨態氮物質的量比為4∶1 的懸浮細胞中的可溶性蛋白比2∶1 的少，但也沒有顯著性差異.

表2 硝態氮與銨態氮物質的量比對可溶性蛋白含量的影響(n＝3)Tab.2 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on soluble protein content of Azadirachta indica A.Juss(n＝3)

可溶性蛋白質是植物所有蛋白質組分中最活躍的一部分，包括各種酶源、酶分子和代謝調節物[17].硝酸鹽含量的增加，可能刺激了印楝愈傷組織中代謝酶的活性，從而使得硝態氮與銨態氮物質的量比為3∶1 和4∶1 的愈傷組織中可溶性蛋白含量提高.但是，同種植物不同組織的生物特性也不盡相同，因此，即使都是由幼葉產生的在相同氮素比例下的愈傷組織和懸浮細胞，二者中的可溶性蛋白變化趨勢不同，含量也不同.

2.3 氮素對印楝素含量的影響

在3 種不同的硝態氮與銨態氮物質的量比下，印楝愈傷組織中的印楝素含量隨硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而增加，并在硝態氮與銨態氮物質的量比為4∶1 時達到最大(37.55,μg/g，以鮮質量計)，硝態氮的增加提高了代謝物印楝素的含量(表3)，這與Prakash 等[6]所報道的硝酸鹽有利于印楝素的積累結果相似.但是，印楝懸浮細胞中的印楝素含量卻是隨著硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而先升高再降低，在硝態氮與銨態氮物質的量比為3∶1 時達到最大(35.61,μg/g，以鮮質量計)，這與Sujanya 等[7]所報道的當硝態氮與銨態氮物質的量比為3∶1 時胞內印楝素含量達到最大的結果相近.

由印楝素在愈傷組織中的遞增變化以及在懸浮細胞中先增后減的變化結果可以看出，相同的誘導源，不同的印楝組織細胞，其生理特性也不同.這與Kumar 等[18-19]所報道的生理特性和環境因素影響印楝組織中的印楝素含量結果相一致.

表3 硝態氮與銨態氮物質的量比對印楝素含量的影響(n＝3)Tab.3 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on azadirachtin content of of Azadirachta indica A.Juss (n＝3)

2.4 氮素對檸檬苦素含量的影響

如表4 所示，在3 種不同的硝態氮與銨態氮物質的量比下，印楝愈傷組織中的檸檬苦素含量隨硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而增加，并在硝態氮與銨態氮物質的量比為4∶1 時達到最大(116.10,μg/g，以鮮質量計)，而在懸浮細胞中的檸檬苦素含量卻隨著硝態氮與銨態氮物質的量比的增加而先升高再降低，在硝態氮與銨態氮物質的量比為3∶1 時達到最大(123.20,μg/g，以鮮質量計).但是，無論在愈傷組織中還是在懸浮細胞中，印楝素含量與檸檬苦素含量表現出同樣的變化趨勢，并且在各個不同的硝態氮與銨態氮物質的量比下，印楝素含量總保持低于檸檬苦素含量水平，并呈正相關，這由印楝素屬于一種檸檬苦素類物質[20]的性質決定.

表4 硝態氮與銨態氮物質的量比對檸檬苦素含量的影響(n＝3)Tab.4 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on limonoid content of of Azadirachta indica A.Juss(n＝3)

盡管培養物中可溶性蛋白含量與印楝素和檸檬苦素含量的變化趨勢相同，但同樣的可溶性蛋白含量，在愈傷組織和懸浮細胞中卻表現出不同的變化趨勢.在愈傷組織中表現出遞增趨勢，而在懸浮細胞中表現出先升后降的趨勢，這可能與其組織中相關代謝酶的活性變化有關[21].

3 結論

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