掌跖角化牙周病綜合征一例及組織蛋白酶C基因突變檢測(cè)

李智銘 劉晶晶 竺海剛 張學(xué)奇 林孝華 李秉煦 徐云升

掌跖角化牙周病綜合征又稱帕皮永-勒菲弗綜合征（Papillon-Lefèvresyndrome,PLS;OMIM:245000），是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，臨床特征為幼兒早期發(fā)生的掌跖角皮病和破壞性牙周炎。PLS的病因和致病機(jī)制尚不完全清楚，遺傳因素和免疫因素被認(rèn)為是主要的病因，而組織蛋白酶C（CTSC）基因的突變可能是PLS的致病基礎(chǔ)［1］。本文報(bào)道1例中國漢族PLS患者的臨床特征和CTSC基因突變。

病歷資料

圖1 掌跖角化牙周病綜合征患者臨床表現(xiàn) 1A：掌跖皮膚角化過度；1B：肘關(guān)節(jié)銀屑病樣皮損；1C：下肢潰瘍、瘢痕；1D：曲面斷層X線片示全口牙槽骨廣泛性吸收

患者男，24歲，漢族。2歲時(shí)出現(xiàn)牙齦紅腫和掌跖、肘、膝、踝關(guān)節(jié)等部位皮膚脫屑、增厚。4歲時(shí)全部乳牙缺失，13歲時(shí)大部分恒牙脫落，同時(shí)皮膚反復(fù)出現(xiàn)膿腫、破潰，愈后留下瘢痕。患者父母無血緣關(guān)系，臨床檢查均正常。體檢：發(fā)育尚可，智力正常。全身淺表淋巴結(jié)無腫大，心、肺、肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)檢查無明顯異常。皮膚科檢查：掌跖皮膚角化過度（圖1A）；肘、膝、踝關(guān)節(jié)等部位可見肥厚性斑塊，上覆白色鱗屑（圖1B）；腹股溝可見環(huán)狀紅斑丘疹伴少許鱗屑；軀干、四肢可見多處潰瘍及瘢痕（圖1C）。口腔科檢查：牙齦紅腫，僅見右上頜尖牙和左下頜第1磨牙。輔助檢查：曲面斷層X線片示全口牙槽骨廣泛性吸收（圖1D）。取腹股溝環(huán)狀皮損處鱗屑直接鏡檢，可見大量孢子和菌絲。流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群：T細(xì)胞占47%（正常值為60%～79%），Th細(xì)胞占26.7%（正常值34%～52%），Th/Tc比值1.17（正常值為1.4～2.0）。X線胸片、心電圖、腹部B超以及頭顱CT檢查均無異常。踝部皮膚組織病理：表皮不規(guī)則角化過度，棘層肥厚，真皮淺層血管周圍少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)典型的臨床特征及組織病理檢查，確診為掌跖角化牙周病綜合征，股癬。

基因突變檢測(cè)

1.外周血DNA提取：采集患者及其父母的外周靜脈血各2ml，同時(shí)取100例健康人靜脈血2 ml作為對(duì)照。用EDTA二鉀鹽抗凝。使用QIAGEN試劑盒抽提基因組DNA，按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

2.PCR擴(kuò)增：采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出CTSC基因所有7個(gè)外顯子和鄰近剪切位點(diǎn)的引物，同時(shí)擴(kuò)增100例健康人的CTSC基因外顯子。PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

3.DNA測(cè)序及突變分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接采用ABI 3730XL測(cè)序儀（美國ABI公司）測(cè)序，Chromas軟件（版本2.0）對(duì)基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，確定突變位點(diǎn)。

4.基因測(cè)序結(jié)果和突變功能預(yù)測(cè)：見圖2。根據(jù)患者的CTSC基因測(cè)序結(jié)果確定了2個(gè)突變，外顯子6的第824位堿基C被T置換（c.824C＞T），此突變導(dǎo)致CTSC基因第275位氨基酸密碼子由ACC替換為ATC，其編碼的氨基酸由蘇氨酸替換為異亮氨酸（p.T275I）；外顯子7的第1040位堿基A被G置換（c.1040A＞G），導(dǎo)致CTSC基因第347位氨基酸密碼子由TAT替換為TGT，其編碼的氨基酸由酪氨酸變?yōu)榘腚装彼幔╬.Y347C）。突變由反向測(cè)序得到驗(yàn)證。患者父親和母親分別為c.824C＞T和c.1040A＞G雜合突變。該突變?cè)?00例健康人對(duì)照中均未檢測(cè)到。由于本研究發(fā)現(xiàn)的CTSC基因均為錯(cuò)義突變，采用Polyphen-2軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)CTSC基因p.T275I和p.Y347C氨基酸突變可能導(dǎo)致的表型效應(yīng)均為“probably damaging”，其預(yù)測(cè)值分別為0.999和1.000。

表1 組織蛋白酶C基因PCR擴(kuò)增引物序列

討 論

Toomes等［1］于1999年將PLS的致病基因定位于11q14.1-q21上的CTSC基因。CTSC基因全長(zhǎng)46 kb，含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白是一種溶酶體蛋白水解酶，后者通過非特異性地去除氨基酸末端二肽，對(duì)免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)的許多蛋白質(zhì)降解和絲氨酸蛋白酶的活化起重要調(diào)節(jié)作用［2］。基因突變會(huì)導(dǎo)致CTSC失活，引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂，發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致牙齒脫落，皮膚和系統(tǒng)感染，甚至伴發(fā)內(nèi)臟膿腫［3-5］。本例PLS患者的T淋巴細(xì)胞和Th淋巴細(xì)胞亞群均低于正常值，提示細(xì)胞免疫功能低下，出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚化膿性感染和股癬。CTSC基因突變還可能與上皮組織的異常增殖和分化有關(guān)，因此PLS患者常伴有銀屑病樣皮損。

目前，在不同種族的PLS患者中已發(fā)現(xiàn)CTSC基因的70多種突變，包括錯(cuò)義突變、無義突變、插入以及缺失突變。突變主要分布在第6號(hào)外顯子和第7號(hào)外顯子內(nèi)，該編碼區(qū)域是CTSC基因高度保守區(qū)域，突變將影響CTSC活性，使PLS患者CTSC功能幾乎完全喪失［6-8］。本例散發(fā)的PLS患者經(jīng)基因突變檢測(cè)為CTSC基因的復(fù)合型雜合突變，父母均為雜合性突變攜帶者，符合常染色體隱性遺傳模式。患者的CTSC基因突變點(diǎn)分別位于第6外顯子（c.824C＞T）和第7外顯子（c.1040A＞G），其中c.824C＞T突變是CTSC基因的新突變位點(diǎn)。c.824C＞T突變導(dǎo)致CTSC基因第275位氨基酸由蘇氨酸替換為異亮氨酸，而c.1040A＞G突變導(dǎo)致CTSC基因第347位氨基酸由酪氨酸變?yōu)榘腚装彼帷Ｓ捎诘?外顯子和第7外顯子編碼CTSC蛋白的重鏈，上述復(fù)合型雜合突變將改變CTSC多肽區(qū)域的高度保守氨基酸位點(diǎn)，使CTSC蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能受損，最后導(dǎo)致典型的PLS臨床特征。本研究采用Polyphen-2軟件對(duì)p.T275I突變功能影響預(yù)測(cè)值為0.999，對(duì)p.Y347C突變功能影響預(yù)測(cè)值為1.000，生物信息分析也提示，上述雜合突變很可能影響了CTSC蛋白的正常功能。

CTSC基因型與表型關(guān)系復(fù)雜，存在遺傳異質(zhì)性。例如PLS的一個(gè)重要臨床特征是早發(fā)性牙周炎和牙周組織破壞，常導(dǎo)致患者乳牙在5歲前脫落，恒牙在15歲時(shí)開始脫落。但也有病例在12歲時(shí)才出現(xiàn)牙周炎［9］，甚至有病例在40歲時(shí)仍然保持完整的恒牙［10］。近來 Khan 等［11］報(bào)道的病例未檢測(cè)到CTSC基因突變，提示其他基因突變也可能引起PLS。另外，相同的CTSC基因突變除可引起PLS外，也可引起Haim-Munk綜合征，該綜合征除了掌跖角化過度和牙周炎外，還有甲彎曲、蜘蛛腳樣細(xì)長(zhǎng)指趾和肢端骨質(zhì)溶解和扁平足［12］。CTSC基因型與表型的關(guān)系尚待研究。

［1］Toomes C,James J,Wood AJ,et al.Loss-of-function mutations in the cathepsin C gene resultin periodontaldisease and palmoplantar keratosis［J］.Nat Genet,1999,23（4）:421-424.

［2］Rao NV,Rao GV,Hoidal JR.Human dipeptidyl-peptidase I.Gene characterization,localization,and expression ［J］.J Biol Chem,1997,272（15）:10260-10265.

［3］Hewitt C,McCormick D,Linden G,et al.The role of cathepsin C in Papillon-Lefèvre syndrome, prepubertal periodontitis, and aggressive periodontitis［J］.Hum Mutat,2004,23（3）:222-228.

［4］Dalgic B,Bukulmez A,Sari S.Pyogenic liver abscess and peritonitis due to Rhizopus oryzae in a child with Papillon-Lefevre syndrome［J］.Eur J Pediatr,2011,170（6）:803-805.

［5］Mansur AT,G?ktay F,Demirok N.A case of Papillon-Lefevre syndrome associated with xanthogranulomatous pyelonephritis and hepatitis［J］.J Dermatol,2006,33（1）:59-63.

［6］Nagy N,Vályi P,Csoma Z,et al.CTSC and Papillon-Lefèvre syndrome:detection of recurrent mutations in Hungarian patients,a review of published variants and database update ［J］.Mol Genet Genomic Med,2014,2（3）:217-228.

［7］Wen X,Wang X,Duan X.High immunoglobulin E in a Chinese Papillon-Lefèvre syndrome patient with novel compound mutations of cathepsin C［J］.J Dermatol,2012,39（7）:664-665.

［8］李曉峰,張雄,章錦才,等.一個(gè)掌跖角化牙周病變綜合征家系的組織蛋白酶C基因突變分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2008,25（5）:502-505.

［9］Ragunatha S,Ramesh M,Anupama P,et al.Papillon-Lefèvre syndrome with homozygous nonsense mutation of cathepsin C gene presenting with late-onset periodontitis［J］.Pediatr Dermatol,2015,32（2）:292-294.

［10］Kobayashi T,Sugiura K,Takeichi T,et al.The novel CTSC homozygous nonsense mutation p.Lys106X in a patient with Papillon-Lefèvre syndrome with all permanent teeth remaining at over 40 years of age［J］.Br J Dermatol,2013,169（4）:948-950.

［11］Khan FY,Jan SM,Mushtaq M.Papillon-Lefevre syndrome（PLS）without cathepsin C mutation:A rare early onset partially penetrant variant of PLS［J］.Saudi Dent J,2014,26（1）:25-28.

［12］Rai R,Thiagarajan S,Mohandas S,et al.Haim Munk syndrome and Papillon Lefevre syndrome--allelic mutations in cathepsin C with variation in phenotype［J］.Int J Dermatol,2010,49（5）:541-543.