梅毒螺旋體粘附于人腦微血管內皮細胞的實驗研究

吳凡 張瑞麗 張津萍 王千秋

近10年，我國梅毒發病率逐年升高，其中三期梅毒發病率年均增長20.92%［1］。神經梅毒是三期梅毒的表現形式之一，它是由梅毒螺旋體侵犯中樞神經系統引起的一種慢性感染性疾病，國內已有學者研究本病的臨床特點，但尚無發病機制的相關研究報道［2-3］。神經梅毒作為一種經血源播散的感染性疾病，血液循環中的梅毒螺旋體粘附并穿越血腦屏障是神經梅毒發病機制的關鍵步驟之一。但人腦微血管內皮細胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）作為血腦屏障的重要組成部分，與外周血管內皮細胞存在較大差異，如細胞間存在大量的緊密連接，內皮細胞跨膜電阻高，缺乏胞飲囊泡等［4］。本研究將梅毒螺旋體與原代HBMEC混合培養，采用掃描電鏡技術和暗視野顯微鏡檢查計數法觀察梅毒螺旋體與HBMEC的粘附情況，為進一步研究神經梅毒的發病機制提供理論基礎和新的研究思路。

材料和方法

一、材料

1.動物及細胞來源：3月齡成年雄性新西蘭大白兔購自江蘇省金陵種兔場，于中國醫學科學院皮膚病研究所實驗動物中心按要求喂養，合格證號為201403098。體重2.5～3 kg，快速血漿反應素環狀卡片實驗（RPR）陰性。梅毒螺旋體Nichols株由廈門大學附屬中山醫院楊天賜教授饋贈。原代HBMEC生產于Cell Systems公司。

2.主要試劑與儀器：內皮細胞完全培養液（美國Cell Systems公司），EDTA-胰蛋白酶消化液（美國Gibco公司），暗視野顯微鏡（日本Nikon公司），EX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），S-3000N型掃描電鏡（日本Hitachi公司）。

二、方法

1.原代HBMEC的復蘇與培養：從液氮容器中取出HBMEC凍存管，迅速置于37℃水浴鍋中后，200×g離心5 min，棄上清液。內皮細胞完全培養液重懸細胞，接種于培養瓶中，37℃5%CO2培養，選擇3～6代細胞進行實驗。

2.梅毒螺旋體培養：雙側兔睪丸分別注射1×107～3×107條梅毒螺旋體，每周觀察3次兔睪丸的大小和硬度，判斷是否形成睪丸炎，睪丸炎明顯時處死實驗動物，無菌條件下取下雙側睪丸，組織剪碎后加提取液于室溫下振蕩30 min，取組織液于室溫下1000×g離心10min，取上清液，4℃下12000×g離心30 min。移去上清液，加適量細胞培養液稀釋沉淀物至 4 × 106條/ml、8 × 106條/ml、1.6 × 107條/ml。

3.掃描電鏡觀察：將直徑為14 mm的圓形蓋玻片置于24孔細胞培養板中，每孔接種2×105個HBMEC，37℃5%CO2培養，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞融合達40%左右用于實驗。實驗前2 h移去舊培養液，換新鮮培養液，然后加入1.6×107條/ml梅毒螺旋體懸液，于混合培養0.5、2、4 h后取出蓋玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，加預冷的2.5%戊二醛4℃固定16 h，1%鋨酸固定1 h，乙醇梯度脫水，冷凍，噴金，掃描電鏡下觀察并照相。

4.梅毒螺旋體粘附實驗：HBMEC培養方法同上，細胞融合達40%左右用于實驗。實驗前2 h移去舊培養液，換新鮮培養液，加入不同密度（4×106/ml、8× 106/ml、1.6× 107/ml）梅毒螺旋體懸液，每孔 500 μl，37 ℃ 5%CO2培養，于混合培養 2、4、6、16 h 后移除上清液，取出蓋玻片，PBS沖洗3次，暗視野顯微鏡下計數20個細胞上粘附的梅毒螺旋體數目，重復觀察3次，獨立進行2次實驗。

結 果

一、掃描電鏡觀察

梅毒螺旋體主體呈均勻的細條型，含8～12個螺旋，兩端逐漸變尖，呈錐形，無法辨別頭端和尾端。混合培養0.5 h后就有梅毒螺旋體粘附于HBMEC表面（圖1A）。混合培養2、4 h后，HBMEC表面吸附的梅毒螺旋體數量逐漸增加，且表現為集中吸附于HBMEC細胞膜的某一區域（圖1B、1C）。混合培養4 h，可見多條梅毒螺旋體吸附于細胞膜上相近位置（圖1D、1E、1F），有1條梅毒螺旋體已部分進入HBMEC下方，另外一部分位于細胞外（圖1E）；有2條梅毒螺旋體與HBMEC粘附的部位已經與細胞膜部分融合（圖1F）。

二、梅毒螺旋體與HBMEC的粘附情況

加入不同密度的梅毒螺旋體懸液與HBMEC混合培養后，不同培養時間及不同密度組間梅毒螺旋體粘附數目差異均有統計學意義（F=387.72、593.23，均P＜0.001），且培養時間與密度存在交互作用（F=98.74，P＜0.001），即不同密度組梅毒螺旋體粘附數目隨時間變化的趨勢不同（表1）。進一步分析單獨效應，在固定梅毒螺旋體懸液各密度條件下，不同時間點之間的梅毒螺旋體粘附數目比較，差異均有統計學意義（P＜0.001），且各培養時間點不同密度組梅毒螺旋體粘附數目比較，差異亦均有統計學意義（P＜0.001）。在3個不同密度組中，梅毒螺旋體粘附數量隨培養時間的延長而增加，6 h時達到高峰，然后呈下降趨勢。兩兩比較發現，4×106條/ml和8×106條/ml組中4和6 h間粘附數量差異無統計學意義，8×106條/ml組2和16 h間粘附數量的差異無統計學意義（P=0.374、0.922、0.206），其余時間點間差異均有統計學意義（均P＜0.001）；1.6×107條/ml組中每個時間點粘附數量差異均有統計學意義（均為P＜0.001）。此外，除培養2h時8×106條/ml和1.6×107條/ml組的粘附數量差異無統計學意義（P=0.730），其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

圖1 梅毒螺旋體與人腦微血管內皮細胞（HBMEC）粘附的掃描電鏡觀察 1A：混合培養0.5 h，可見梅毒螺旋體與HBMEC粘附；1B：混合培養2 h；1C：混合培養4 h，HBMEC吸附的梅毒螺旋體數量逐漸增加；1D：混合培養4 h，數條梅毒螺旋體集中粘附于細胞膜上；1E：混合培養4 h，1條梅毒螺旋體部分“鉆入”HBMEC下方，而細胞膜表面完整；1F：混合培養4 h，在吸附部位梅毒螺旋體末端與細胞膜發生融合

表1 梅毒螺旋體與人腦微血管內皮細胞共培養不同時間的粘附情況

討 論

神經梅毒是梅毒螺旋體感染中樞神經系統后引起的一種感染性疾病，本病發病隱匿，臨床表現復雜多樣且缺乏特征性，是一種誤診率高達73.3%的疾病［5］。梅毒螺旋體作為一種侵襲性病原菌已被證實可在體外培養環境下粘附并穿越人真皮微血管內皮細胞、人主動脈內皮細胞、人臍靜脈內皮細胞和Hela細胞等多種人體細胞［6-7］。本研究選擇原代HBMEC作為實驗細胞，加入具有活力的梅毒螺旋體混合培養，利用掃描電鏡和暗視野顯微鏡觀察梅毒螺旋體與細胞的粘附情況。結果顯示，梅毒螺旋體的粘附率整體呈現先上升，4 h達最大值，而后逐漸下降的趨勢。Hayes 等［8］將梅毒螺旋體分別與兔睪丸細胞和HEP-2在不同的溫度下混合培養，結果顯示，隨著培養溫度的升高，細胞上粘附的梅毒螺旋體數量逐漸增加，37℃時粘附率最高，且在2 h時梅毒螺旋體的粘附數量達到最大，指出梅毒螺旋體的粘附程度依賴于培養溫度和梅毒螺旋體的活力。因為梅毒螺旋體缺乏某些物質代謝的關鍵酶，所以必須依賴宿主提供的營養成分才能增殖和致病，利用與動物細胞在體外共同培養的方法可延長梅毒螺旋體的存活時間和毒力保持時間［9-11］。我們在暗視野顯微鏡下觀察到粘附在細胞上的梅毒螺旋體仍具有活力，部分梅毒螺旋體甚至呈高速螺旋式運動，而部分未粘附的梅毒螺旋體也具有活力，混合培養16 h后粘附的梅毒螺旋體仍具有較高的活性。

在體內，當梅毒螺旋體引起播散性系統感染時，傾向粘附于具有高濃度糖胺聚糖的組織或代謝旺盛的組織，如真皮、睪丸、主動脈、眼、胎盤、臍帶等［12］。梅毒螺旋體離開宿主后迅速失去活力，逐漸喪失對細胞的粘附能力，數小時后死亡。將梅毒螺旋體與不同來源的細胞混合培養時，梅毒螺旋體傾向粘附于生長活躍的細胞上，而粘附于細胞的梅毒螺旋體比未粘附的梅毒螺旋體的存活時間更長，提示梅毒螺旋體與細胞的粘附情況還依賴于宿主的代謝狀態。雖然粘附在梅毒螺旋體感染過程中的作用尚未完全清楚，但研究者推測，一方面粘附于宿主細胞可以為梅毒螺旋體提供必要的營養物質和生長因子，減少氧氣對梅毒螺旋體的毒性，另一方面粘附可能直接與梅毒螺旋體的增殖有關［13］。HBMEC作為血腦屏障的重要組成部分，其代謝旺盛，生化特性不同于外周血管內皮細胞，梅毒螺旋體粘附于HBMEC的分子機制尚需深入研究和探索。

掃描電鏡觀察，發現了一些暗視野顯微鏡和相差顯微鏡下無法觀察到的粘附細節。混合培養0.5 h后就觀察到梅毒螺旋體粘附于HBMEC上，隨著混合培養時間的延長，HBMEC表面粘附的梅毒螺旋體數量逐漸增加，且呈現出群集吸附于細胞膜上的現象。粘附的聚集現象可能與細胞膜的流動性有關，細胞受到梅毒螺旋體刺激后，表面的受體隨細胞膜的流動聚集于最初的粘附部位，進而吸引更多的梅毒螺旋體粘附于該處細胞膜表面。Fitzgerald等［14］利用掃描電鏡觀察梅毒螺旋體與兔睪丸細胞和人皮膚上皮細胞的粘附情況，發現在粘附部位梅毒螺旋體本身和細胞表面均未觀察到結構和形態的變化，指出梅毒螺旋體與細胞的粘附似乎是一種物理靠近。研究證實，梅毒螺旋體粘附于細胞之上并不破壞細胞的物理結構，不影響細胞的活性，也不引起細胞凋亡［15］。但我們在電鏡下觀察到1條梅毒螺旋體的大部分已與細胞膜融合，而剩余部分仍位于細胞外（圖1E），有2條梅毒螺旋體的末端已經與細胞膜部分融合（圖1F）。我們猜測梅毒螺旋體可能具有溶解HBMEC細胞膜的能力，但溶解過程并不引起細胞的活性改變，細胞可通過自我修復使細胞膜再度恢復完整。梅毒螺旋體也可能是通過其尖端吸附于HBMEC后，利用菌體螺旋運動產生的動力從細胞邊緣“鉆”入細胞下方，進而通過HBMEC單層。HBMEC是一種終末微血管內皮細胞，是血腦屏障的重要組成部分，梅毒螺旋體粘附HBMEC的方式可能與梅毒螺旋體粘附于其他組織細胞的方式不同。梅毒螺旋體的粘附是否會破壞HBMEC膜的物理完整性、影響細胞的活性，是否會引起細胞的生化特性改變，還需進一步深入探討。

本研究結果顯示，梅毒螺旋體可粘附于體外培養的HBMEC表面，粘附數量在混合培養4 h達到最大值。梅毒螺旋體與HBMEC的粘附可能涉及細胞膜表面的融合，這在神經梅毒發病中可能起一定的作用。本研究存在兩點不足，一方面，利用暗視野顯微鏡進行粘附計數不夠精確，僅能粗略地反應每個細胞上大概粘附的梅毒螺旋體數量；另一方面，掃描電鏡照片不能觀察亞細胞水平的變化。因此，后續研究中需進一步使用qPCR等分子生物學方法進行驗證，同時可以利用透射電鏡深入分析梅毒螺旋體與HBMEC粘附的作用方式。

［1］龔向東,岳曉麗,滕菲,等.2000-2013年中國梅毒流行特征與趨勢分析［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（5）:310-315.

［2］張利貞,滕弘,李薇,等.神經梅毒的臨床特點［J］.臨床神經病學雜志,2013,26（4）:272-274.

［3］毛晨暉,高晶,黃顏,等.伴顳葉內側病變的神經梅毒三例臨床、影像特點和機制探討［J］.中華神經科雜志,2013,46（1）:22-25.

［4］GeorgievaJV,HoekstraD,ZuhornIS.Smugglingdrugsintothebrain:an overview of ligands targeting transcytosis for drug delivery across the blood-brain barrier［J］.Pharmaceutics,2014,6（4）:557-583.

［5］Yang T,Tong M,Xi Y,et al.Association between neurosyphilis and diabetes mellitus:resurgence of an old problem ［J］.J Diabetes,2014,6（5）:403-408.

［6］ThomasDD,NavabM,HaakeDA,etal.Treponema palliduminvades intercellular junctions of endothelial cell monolayers［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,1988,85（10）:3608-3612.

［7］Lee JH,Choi HJ,Jung J,et al.Receptors forTreponema pallidumattachment to the surface and matrix proteins of cultured human dermal microvascular endothelial cells［J］.Yonsei Med J,2003,44（3）:371-378.

［8］Hayes NS,Muse KE,Collier AM,et al.Parasitism by virulentTreponema pallidumof host cell surfaces［J］.Infect Immun,1977,17（1）:174-186.

［9］Fitzgerald TJ,Miller JN,Sykes JA.Treponema pallidum（Nichols strain）in tissue cultures:cellular attachment,entry,andsurvival［J］.Infect Immun,1975,11（5）:1133-1140.

［10］Graves SR,Sandok PL,Jenkin HM,et al.Retention of motility and virulence ofTreponema pallidum（Nichols strain）in vitro［J］.Infect Immun,1975,12（5）:1116-1120.

［11］Sykes JA,Miller JN.Intracellular location ofTreponema pallidum（Nichols strain）in the rabbit testis［J］.Infect Immun,1971,4（3）:307-314.

［12］Fitzgerald TJ.Pathogenesis and immunology ofTreponema pallidum［J］.Annu Rev Microbiol,1981,35:29-54.

［13］Wong GH,Steiner B,Faine S,et al.Factors affecting the attachment ofTreponema pallidumto mammalian cellsin vitro［J］.Br J Vener Dis,1983,59（1）:21-29.

［14］Fitzgerald TJ,Cleveland P,Johnson RC,et al.Scanning electron microscopy ofTreponema pallidum（Nichols strain）attached to culturedmammaliancells［J］.JBacteriol,1977,130（3）:1333-1344.

［15］Fitzgerald TJ,Johnson RC,Sykes JA,et al.Interaction ofTreponema pallidum（Nichols strain）with cultured mammalian cells:effects of oxygen,reducingagents,serum supplements,and different cell types［J］.Infect Immun,1977,15（2）:444-452.