自行制備的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體檢測尖銳濕疣皮損的研究

曹蕾 程浩 王惠 周強 湯怡 姜少杰 丁楊 陳賢禎

尖銳濕疣多由低危型人乳頭瘤病毒6型（HPV-6）和 11 型（HPV-11）感染引起［1］。由于病原學檢測的實驗室要求高，難以在臨床尤其基層醫院進行，造成不典型皮損的尖銳濕疣易誤診或漏診。本研究采用自主研發制備的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體對55例外陰尖銳濕疣皮損進行免疫組化檢測，探討檢測這兩種抗體的臨床意義。

材料與方法

一、材料

1.臨床資料：收集杭州市富陽區第一人民醫院皮膚科2013年9月至2014年10月間確診的55例尖銳濕疣皮損標本。男20例，女35例，年齡17～65（34.07±14.26）歲。53例為首診病例，2例為復發病例。皮損數目不等，女性多分布于外陰，男性多分布于包皮和龜頭。皮損表現典型，多為雞冠或菜花狀皮疹，醋酸白試驗陽性。皮損活檢病理可見典型的尖銳濕疣改變［2］。

2.主要試劑：免疫組化所用一抗HPV6b和11型E7蛋白兔多克隆抗體由浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院皮膚科和生物醫學研究中心自行研發制備。二抗為兔鼠混合型試劑盒（美國Invitrogen公司）。反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）所用試劑為DL2000 DNA Marker［寶生物工程（大連）有限公司］，瓊脂糖（西班牙Biowest公司），Trizol（美國Invitrogen公司），Taq酶mix（美國Promega公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

二、方法

1.標本處理：局麻下用血管鉗夾取部分疣體組織，生理氯化鈉液沖洗后置入4%甲醛固定，常規組織病理檢查，HE染色。其中18例同時取疣體-80℃冰凍保存。

2.免疫組化染色：55份尖銳濕疣皮損標本分別進行HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體免疫組化EnVision法染色：121℃高壓修復抗原，室溫下一抗（HPV6b和11型E7蛋白抗體稀釋度分別為1∶1 000和1∶500）孵育60～90 min，二抗羊抗鼠/兔 IgG 孵育30 min，DAB色源底物溶液孵育1～3 min，其余步驟按試劑盒說明書操作。

3.結果觀察和分析：鏡下觀察細胞染色情況，結合陽性細胞所占百分比和染色強度進行分析。每視野下染色陽性細胞所占皮損表皮細胞總數的百分比評定：陰性為0分，陽性細胞數≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度評定：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據兩項評分之乘積判斷結果：≤ 1為陰性（-），2～3為弱陽性（+），4～5為中度陽性（++），≥6為強陽性（+++），且認定+～+++為陽性表達［3-4］。每張HPV6b或11型E7陽性表達的免疫組化切片均在高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，計算每個視野中表皮各層HPV6b、11型E7蛋白陽性表達細胞數與各層細胞總數之比，取均數為表皮各層陽性表達細胞分布密度。

4.RT-PCR檢測E7蛋白mRNA表達：設計檢測HPV6b及11型E7基因的引物。HPV6b型E7基因引物（297 bp），正向 5′-ATGCATGGAAGACATGT TACCC-3′，反向 5′-TTAGGTCTTCGGTGCGCAGA T-3′；HPV11 型 E7 基因引物（297 bp），正向 5′-ATG CATGGAAGACTTGTTACCC-3′，反向 5′-TTATGGT TTTGGTGCGCAGATG-3′；GAPDH 引物（402 bp），正向 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；反向 5′-T TCACACCCATGACGAACAT-3′。Trizol一步法提取標本RNA，并通過紫外分光光度計測定濃度和純度，經RT-PCR獲得的產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照分析。

5.統計學方法：采用SPSS17.0軟件，數據分別采用χ2檢驗、單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、HPV6b和11型E7抗體免疫組化法檢測尖銳濕疣皮損

免疫組化染色顯示（圖1），HPV6b和11型E7蛋白為表皮細胞胞核表達，均表現為胞核中棕黃色或棕褐色顆粒。55例尖銳濕疣皮損中HPV6b和11型E7蛋白總陽性表達52例（94.55%），兩型E7蛋白雙陽性表達22例（40.00%），見圖1，兩蛋白均陰性表達3例（5.45%）。HPV6b和11型E7蛋白陽性表達分別為42例（76.36%）和32例（58.18%），HPV6b型E7蛋白抗體陽性率顯著高于HPV11型E7蛋白抗體（χ2=16.764，P=0.001）。兩蛋白在皮損表皮全層均有陽性表達，但基底層細胞表達較多，棘層細胞次之，顆粒層細胞最少，兩型E7蛋白在表皮各層陽性表達的細胞分布密度差異均有統計學意義（均P＜0.001）。見表 1。

二、RT-PCR檢測HPV6b、11型E7 mRNA在尖銳濕疣皮損的表達

采用RT-PCR對18例尖銳濕疣冰凍標本皮損中HPV6b、11型E7 mRNA表達進行檢測，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳可顯示297 bp處明顯的電泳條帶，分子量與E7基因一致，提示HPV6b或11型E7 mRNA表達陽性。HPV6b和11型 E7 mRNA陽性表達分別為15例和10例，其中雙陽性表達7例（圖2）。RT-PCR法檢測HPV6b和11型E7蛋白表達型別與免疫組化結果一致，符合率均為100%，且雙陽性表達結果也完全一致。

圖1 自制HPV6b和11型E7多克隆抗體免疫組化法檢測同一份尖銳濕疣皮損（免疫組化EnVision法×100） 1A、1B：同一份尖銳濕疣皮損兩型E7蛋白均表達陽性；1C、1D：同一份尖銳濕疣皮損HPV6b型E7蛋白陽性表達（1C），HPV11型E7蛋白表達陰性（1D）；1E、1F：同一份尖銳濕疣皮損HPV6b型E7蛋白表達陰性（1E），HPV11型E7蛋白表達陽性（1F）

討 論

HPV早期基因編碼的E7蛋白在HPV感染進程中通過多種途徑發揮作用。本實驗所用HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體是將自行構建表達并純化的E7蛋白免疫新西蘭兔后獲得的兔多克隆抗體IgG，經Western印跡及免疫熒光鑒定，該兔抗IgG具有高效價性和抗HPV6b和11型E7蛋白特異性［5-6］。我們用這兩型抗體，采用免疫組化法檢測55份尖銳濕疣皮損標本，兩抗體總陽性檢出率為94.55%，高于陳玨［7］和顏丹等［8］的原位雜交及 FQ-PCR 檢測結果。朱小霞等［9］用熒光定量PCR法檢測尖銳濕疣皮損HPV6和11型，結果與本實驗相似。本實驗中兩蛋白陽性檢出率不同，有22份標本為HPV6b和11重疊感染，提示兩型抗體無交叉反應。18例皮損組織通過RT-PCR法檢測發現，HPV6b和11型的E7 mRNA陽性表達及型別與免疫組化結果完全一致，提示該兩型抗體對尖銳濕疣皮損HPV6b、11的免疫組化檢測敏感性好，特異性強，與尖銳濕疣臨床診斷符合率高。有3例檢測結果陰性，考慮有可能為HPV其他型感染。金納等［10］用 HPV6 和 11 型 E6 基因引物介導PCR法檢測發現，HPV11型明顯多于 6b型，與本實驗結果有一定差異，可能與受檢人群的差異及檢測方法不同有關。

表1 尖銳濕疣皮損組織HPV6b和11型E7蛋白在表皮各層陽性表達細胞分布（%，±s）

表1 尖銳濕疣皮損組織HPV6b和11型E7蛋白在表皮各層陽性表達細胞分布（%，±s）

注：a：表皮各層陽性表達細胞分布比較

H P V亞型 例數 基底層 棘層 顆粒層 F值a P值6 b 4 2 4 1.9 3 7±2 4.1 7 4 2 3.7 3 2±1 6.8 2 8 7.3 8 2±9.2 2 2 8 6.3 1 3 ＜0.0 0 1 1 1 3 2 2 7.7 9 6±2 5.8 8 5 1 9.0 3 6±2 1.4 9 8 5.6 6 2±1 2.5 5 5 3 4.0 6 3 ＜0.0 0 1

圖2 尖銳濕疣皮損中HPV6b、11型E7 mRNA RT-PCR擴增產物電泳圖 M：DL2000 DNA Marker；1～ 18：尖銳濕疣皮損標本

我們發現，HPV6b和11型E7蛋白在皮損表皮全層細胞均有陽性表達，但基底層細胞較多，棘層次之，顆粒層最少，提示用這兩型抗體進行的免疫組化檢測可非常直觀地觀察到HPV6b和11感染細胞。余俐等［11］用原位雜交和殼抗原免疫組化法檢測尖銳濕疣皮損，發現兩方法的陽性細胞主要位于表皮淺層，與本實驗結果有一定差異。我們分析可能原因有：①原位雜交檢測HPV DNA而非蛋白的表達；②病毒感染基底層細胞進行DNA復制，并隨著細胞分化進入表皮淺層，而E7和L1蛋白分別與HPV早期和晚期蛋白有關。但確切原因還需增加樣本量作進一步研究。

綜上，本研究采用自行制備的HPV6b和11型E7蛋白抗體免疫組化法檢測尖銳濕疣皮損，檢測結果直觀，可以觀察到HPV6b和11型感染細胞在病損中的分布位置。檢測方法簡便易行，便于在有病理科的基層醫院開展。

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