氨基酮戊酸光動力療法抑制成纖維細胞生長因子10誘導的HaCaT細胞過度角化及增殖的機制研究

易飛 Maya Valeska Gozali張家安 周炳榮 駱丹 張麗超 王申 劉娟 吳紅巾

氨基酮戊酸光動力療法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）不僅對炎癥性痤瘡皮損有改善作用，對非炎癥性痤瘡皮損（如粉刺等）亦有顯著的改善作用［1-2］。此外，ALA-PDT療法在治療痤瘡的過程中，同時還作用于毛囊皮脂腺導管上皮細胞的角化過程，但是該作用機制尚未得到完全明確［3-5］。目前尚未在體外模型中進行ALA-PDT療法對細胞過度角化的影響及其機制的研究。本研究以成纖維細胞生長因子10（fibroblast growth factor 10，FGF-10）誘導的HaCaT細胞過度角化及增殖模型為研究對象，探討ALA-PDT對該模型角化及增殖指標的影響，初步探討其作用機制。

材料與方法

一、材料與儀器

HaCaT細胞由上海長海醫院皮膚科惠贈。氨基酮戊酸粉劑（上海復旦張江生物醫藥股份有限公司，商品名為艾拉，批號130702），FGF-10（美國R&D system公司），胰酶（美國Amresco生物公司），培養基為含10%胎牛血清DMEM（美國Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit 8，上海碧云天生物技術有限公司），實時定量PCR試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），白細胞介素1α（IL-1α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D system公司），兔抗人多克隆抗角蛋白 6（keratin-6，K6）、K16、K1 抗體（美國Abcam公司），兔抗人多克隆抗角質形成細胞生長因子受體抗體（KGFR，美國Santa Cruz公司）。XD-635AB型光動力激光治療儀（波長635 nm，上海復旦張江生物醫藥股份有限公司），FV500型共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

二、方法

1.HaCaT細胞培養與傳代：HaCaT細胞培養于37℃、5%CO2條件培養箱中。80%融合時以0.25%胰酶消化，用含10%小牛血清的DMEM培養基調整為1×106/ml，定量接種于10 cm培養皿中，待其貼壁長至70%～80%融合時用于實驗。

2.處理及分組：HaCaT細胞共分為4組，空白對照組（無任何處理），FGF-10組（加入FGF-10孵育24 h），ALA-PDT組（ALA孵育24 h后紅光照射），FGF-10+ALA-PDT組（FGF-10孵育24 h后，再加ALA孵育24 h后紅光照射）。FGF-10以薄層磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解后，-20℃避光保存，使用時吸除細胞培養基，細胞表面覆以PBS，加入濃度為100 μg/L的FGF-10，孵育24 h后吸除FGF-10，換含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。ALA溶液為現配的1 mmol/L ALA+DMEM培養液，加入細胞培養皿中避光培養24 h，棄去培養液，PBS漂洗3遍，加入1 ml PBS防止干涸，采用635 nm紅光照射，距離細胞10 cm，功率50 mW/cm2，光照后棄去原培養液，PBS洗3遍，吸盡液體。另外，在ELISA檢測實驗組中，用不含小牛血清的DMEM培養基培養。各組按上述要求處理后24 h進行下面的檢測。

3.HaCaT細胞增殖活性檢測：按上述分組處理后，每孔再加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續孵育1 h，選擇波長490 nm，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度（A值），實驗重復3次。

4.Western 印跡法檢測 K1、K6、K16、KGFR：經上述分組處理后，分別提取細胞總蛋白，將蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），250 V 電壓下電泳 2 h，200 mA 100 V 轉印1 h，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉液中封閉，4℃過夜，棄去封閉液，不洗。封閉后按實驗分組分別加入一抗 K1（1∶10000）、K6（1∶5000）、K16（1 ∶1 000）、KGFR（1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜，再加入二抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶標記抗體，用封閉液（1∶5 000）室溫下振蕩孵育2 h，顯色液室溫下顯色。用灰度分析軟件Image Tool 3.00進行條帶分析。

5.ELISA法檢測細胞上清液中IL-1α蛋白：空白對照組僅DMEM培養72 h；FGF-10組加DMEM培養24 h后，加入FGF-10孵育24 h，再換DMEM培養24 h；ALA-PDT組加DMEM培養48 h后,再加ALA孵育24 h后紅光照射；FGF-10+ALA-PDT組加DMEM培養24 h后加入FGF-10孵育24 h，再加ALA孵育24 h后紅光照射。照射紅光后需避光3 h。嚴格按照ELISA試劑盒測定方法檢測上述各組細胞上清液IL-1α的含量，按操作說明測量波長為450 nm時的A值。

6.細胞免疫熒光法檢測KGFR和K6表達：將上述各組細胞用固定液固定10 min，洗滌后加入免疫封閉液封閉1 h，再洗滌后分別加入KGFR（1∶500）和 K6（1 ∶100）抗體，4 ℃過夜，次日洗滌后加入羊抗兔IgG，濕盒中避光孵育37℃1 h，洗滌后加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液對核進行復染5 min，37℃避光染色，加入抗熒光淬滅劑封片觀察。用高倍鏡（×400）觀察樣品，DAPI由氬離子激光器358 nm激發，分辨率為1 024×1 024，發射波長為460 nm。

7.統計學方法：采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用析因設計資料的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、ALA-PDT對FGF-10誘導的HaCaT細胞增殖的影響

析因分析顯示，各組經處理后24 h，ALA-PDT和FGF-10對HaCaT細胞增殖無交互作用（F交互=1.369，P=0.276），FGF-10 對 HaCaT 細胞增殖有促進作用（F=20.853，P＜0.05），而ALA-PDT對HaCaT細胞增殖有抑制作用（F=24.822，P＜0.05）。FGF-10組細胞增殖活性（A值為1.233±0.099）較空白對照組（0.924±0.024）顯著升高（P＜0.05），而 ALA-PDT組細胞（0.718±0.107）較空白對照組則顯著降低（P＜0.05），FGF-10+ALA-PDT組細胞增殖活性（0.901±0.014）與FGF-10組比較也顯著降低（P＜0.05）。

二、ALA-PDT對FGF-10誘導的HaCaT細胞K1、K6、K16及 KGFR 表達的影響

Western印跡法結果顯示，ALA-PDT和FGF-10對HaCaT細胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表達有交互作用（F交互值分別為 118.370、341.141、403.985、152.647，均P＜0.05），根據相加模型均判斷為負效應。FGF-10促進K1、K6、K16及KGFR蛋白表達（F值分別為 369.832、838.381、328.397、691.260，均P＜0.05），而ALA-PDT抑制這些蛋白的表達（F值分別為 407.319、919.896、788.253、571.337，均P＜0.05）。單獨效應分析顯示，FGF-10組角蛋白K1、K6和K16及KGFR相對表達量均顯著高于空白對照組（均P＜0.05），ALA-PDT組均顯著低于空白對照組（均P＜0.05），而FGF-10+ALA-PDT組顯著均低于FGF-10組（均P＜0.05）。見圖1，表1。

圖 1 Western印跡法檢測HaCaT 細胞角蛋白（K）1、K6、K16、角質形成細胞生長因子受體（KGFR）蛋白表達變化 1：空白對照組；2：成纖維細胞生長因子 10（FGF-10）組；3：ALA-PDT 組；4：FGF+ALA-PDT 組。FGF-10+ALA-PDT 組 K1、K6、K16、KGFR 蛋白表達水平與FGF-10組相比均明顯下降

表1 ALA-PDT與FGF-10對HaCaT細胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表達的影響（±s）

表1 ALA-PDT與FGF-10對HaCaT細胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。ALA-PDT：氨基酮戊酸光動力療法；FGF-10：成纖維細胞生長因子10；K：角蛋白；KGFR：角質形成細胞生長因子受體。a：Western印跡法檢測；b：細胞免疫熒光法檢測

組別 灰度值a K 1 K 6 K 1 6 K G F R K 1 6 K G F R空白對照組 1.0 0 0±0.0 6 1 1.0 0 0±0.1 0 4 1.0 0 0±0.0 5 9 1.0 0 0±0.0 5 6 1 0.5 8 6±2.3 9 5 1 3.5 4 9±1.8 2 8 F G F-1 0組 2.2 9 8±0.1 3 1 3.4 3 8±0.0 9 2 2.9 3 2±0.0 2 4 2.6 3 9±0.1 2 5 7 8.2 8 6±4.7 4 0 7 0.4 2 9±2.3 9 1 A L A-P D T組 0.5 9 9±0.0 2 9 0.3 9 1±0.0 6 3 0.5 9 6±0.1 3 5 0.3 7 0±0.0 2 4 7.6 1 9±1.1 8 1 6.5 0 2±1.2 2 1 F G F-1 0+A L A-P D T組 0.9 5 9±0.0 2 4 0.9 3 0±0.0 9 2 0.4 9 6±0.0 9 1 0.8 9 2±0.0 7 2 1 8.4 6 8±2.9 0 1 4 2.7 8 0±2.0 8 1熒光強度b

圖2 激光共聚焦倒置熒光顯微鏡觀察HaCaT細胞角蛋白6（K6）的免疫熒光圖像（×400） 藍色為4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液標記，指示核區；綠色指示K6，熒光強度越強，表達越高。成纖維細胞生長因子10（FGF-10）+ALA-PDT組K6熒光強度與FGF-10組相比明顯下降

圖3 激光共聚焦倒置熒光顯微鏡觀察HaCaT細胞角質形成細胞生長因子受體（KGFR）的免疫熒光圖像（×400） 藍色為4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液標記，指示核區；綠色指示KGFR，熒光強度越強，表達越高。成纖維細胞生長因子10（FGF-10）+ALA-PDT組KGFR熒光強度與FGF-10組相比明顯下降

細胞免疫熒光法檢測顯示，ALA-PDT和FGF-10對HaCaT細胞K6和KGFR免疫熒光強度有交互作用（F交互=173.174、85.561，均P＜ 0.05），且為負效應。FGF-10可增強K6和KGFR免疫熒光強度（F值分別為 370.766、1 749.468，均P＜ 0.05），而ALA-PDT降低K6和KGFR免疫熒光強度（F值分別為 219.810、242.681，均P＜ 0.05）。單獨效應分析顯示，FGF-10組K6和KGFR免疫熒光強度均顯著高于空白對照組（均P＜0.05），ALA-PDT組低于空白對照組（均P＜0.05），FGF-10+ALA-PDT組低于FGF-10組（均P＜0.05）。見圖 2、3，表1。

三、ALA-PDT對FGF-10誘導的HaCaT細胞IL-1α蛋白分泌的影響

ELISA法結果顯示，ALA-PDT和FGF-10對HaCaT細胞IL-1α蛋白分泌無交互作用（F交互=0.006，P=0.939）。FGF-10 會增加 IL-1α 蛋白分泌（F=14.996，P＜0.05），而ALA-PDT對其沒有影響（F=0.584，P=0.467）。FGF-10組IL-1α 蛋白分泌水平（A值為0.282±0.029）顯著高于空白對照組（0.207±0.036），差異有統計學意義（P＜0.05）；ALA-PDT組（0.194±0.035）與空白對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；FGF-10+ALA-PDT組（0.266±0.031）顯著低于FGF-10組（P＜0.05）。

討 論

大量研究證實，FGF-10能促進角質形成細胞的增殖及過度角化［6］。同時發現，FGF-10能促進毛囊導管上皮細胞過度角化，產生粉刺、炎癥等一系列改變［7］。有研究［4］認為，當給予適宜波長的光進行照射時，不僅可以激活痤瘡丙酸桿菌自身產生的內源性卟啉，還能同時活化外源性ALA所轉換的PpIX（原卟啉IX），產生ROS，通過選擇性地殺傷痤瘡丙酸桿菌和破壞毛囊皮脂腺而改善痤瘡癥狀。然而，H?rfelt等［4］使用 20%ALA+ 不同紅光照射劑量方案治療后發現，明顯改善的痤瘡皮損中皮脂腺分泌水平和痤瘡丙酸桿菌的相對數量都沒有發生明顯改變，認為ALA-PDT療法在改善痤瘡的過程中，可能同時還作用于毛囊皮脂腺導管上皮細胞的角化過程。我們通過前期研究和查閱文獻［8-9］，分別選擇 1 mmol/L ALA 和 100 μg/L FGF-10，孵育 3 h，紅光照射劑量為50 mW/cm2。在本實驗中，HaCaT細胞經FGF-10孵育后，與空白對照組相比，角蛋白K6、K16及K1表達增加，進一步驗證了FGF-10確實可誘導角質形成細胞的過度角化。進一步發現，ALAPDT能下調FGF-10誘導的HaCaT細胞K6、K16及K1蛋白的表達，提示ALA-PDT可抑制角質形成細胞過度角化及增殖。

大量研究表明，IL-1α能誘導角質形成細胞的過度角化［10］，Guy 和 Kealey［11］在體外分離培養的毛囊皮脂腺導管模型中，加入1 μg/L IL-1α可以促進毛囊皮脂腺導管的角化過度。此外，開放性粉刺中含有高濃度的IL-1α，在毛囊皮脂腺導管上皮細胞中IL-1α的濃度是其他組織的1 000倍［12］。毛囊皮脂腺導管上皮細胞角化過度和增生過度常伴隨著K1、K6和K16的過度表達，IL-1α能通過自分泌方式誘導K1、K6和K16表達，激活基底層的角質形成細胞［13］。多種具有明確抗痤瘡作用的藥物（如異維A酸、抗雄激素藥物、過氧苯甲酰等）均可通過下調IL-1α表達來發揮療效［14］。在本實驗中我們發現，ALA-PDT能下調FGF-10誘導的HaCaT細胞IL-1α蛋白的表達，提示ALA-PDT調節角化異常的作用可能與抑制IL-1α的表達相關。

KGFR/FGFR2b信號通路也被認為和毛囊漏斗部的過度角化有關［7，15-16］。KGFR/FGFR2b 是一類跨膜的酪氨酸激酶受體，有兩個亞型，分別是FGFR2b和FGFR2c。KGFR/FGFR2b主要分布在表皮的棘層和皮脂腺細胞，可與FGF-10特異性結合［17］。KGFR/FGFR2b受體蛋白激活后可啟動下游通路，即激活磷脂酶C-蛋白激酶C（PLC/PKC）通路，其主要誘導IL-1α生成及后續過度角化進程的發生。Melnik等［14］提出，過氧苯甲酰可以降解KGFR/FGFR2b受體，從而對KGFR/FGFR2b信號通路下游機制和效應發揮抑制作用。在本實驗中，使用免疫熒光和免疫印跡法均證實了ALA-PDT在FGF-10誘導HaCaT細胞過度角化過程中可以減少KGFR蛋白的表達。我們認為ALA-PDT對角質形成細胞IL-1α分泌及細胞角化指標的作用與其抑制KGFR/FGFR2b信號通路密切相關。

綜上所述，本研究證實，ALA-PDT可能通過KGFR/FGFR2b信號通路抑制FGF-10誘導的HaCaT細胞過度角化及增殖，這一機制的發現為解釋ALA-PDT治療非炎癥性皮損現象提供理論依據，但仍需進一步的體內外研究予以深入研究。

［1］林孟盈,丁蕙琳,項蕾紅.5%5-氨基酮戊酸光動力療法治療痤瘡的隨機對照研究［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（2）:81-84.

［2］Hongcharu W,Taylor CR,Chang Y,et al.Topical ALA-photodynamic therapy for the treatment of acne vulgaris［J］.J Invest Dermatol,2000,115（2）:183-192.

［3］Pollock B,Turner D,Stringer MR,et al.Topical aminolaevulinic acid-photodynamic therapy for the treatment of acne vulgaris:astudy of clinical efficacy and mechanism of action ［J］.Br J Dermatol,2004,151（3）:616-622.

［4］H?rfelt C,Stenquist B,Lark? O,et al.Photodynamic therapy for acne vulgaris:a pilot study of the dose-response andmechanism of action［J］.Acta Derm Venereol,2007,87（4）:325-329.

［5］Youn SW.The role of facial sebum secretion in acne pathogenesis:facts and controversies［J］.Clin Dermatol,2010,28（1）:8-11.

［6］Cuevas Sánchez P,Espinoza W,Pérez C,et al.Topical treatment of actinic keratoses with potassium dobesilate 5% cream.a preliminary open-labelstudy［J］.Eur J Med Res,2011,16（2）:67-70.

［7］Melnik B,Schmitz G.FGFR2 signaling and the pathogenesis of acne［J］.J Dtsch Dermatol Ges,2008,6（9）:721-728.

［8］張麗超,張海榮,周炳榮,等.氨基酮戊酸光動力療法誘導中波紫外線應激性衰老成纖維細胞發生凋亡［J］.中華皮膚科雜志,2015,48（4）:256-260.

［9］Saito S,Morishima K,Ui T,et al.The role of HGF/MET and FGF/FGFR in fibroblast-derived growth stimulation and lapatinib-resistance of esophageal squamous cell carcinoma［J/OL］.BMC Cancer,2015,15:82.

［10］Jeremy AH,Holland DB,Roberts SG,et al.Inflammatory events are involved in acne lesion initiation［J］.J Invest Dermatol［J］.2003,121（1）:20-27.

［11］Guy R,Kealey T.Modelling the infundibulum in acne［J］.Dermatology,1998,196（1）:32-37.

［12］Hauser C,Saurat JH,Schmitt A,et al.Interleukin 1 is present in normal human epidermis［J］.J Immunol,1986,136 （9）:3317-3323.

［13］Freedberg IM,Tomic-Canic M,Komine M,et al.Keratins and the keratinocyte activation cycle［J］.J Invest Dermatol,2001,116（5）:633-640.

［14］Melnik BC,Schmitz G,Zouboulis CC.Anti-acne agents attenuate FGFR2 signal transduction in acne ［J］.J Invest Dermatol,2009,129（8）:1868-1877.

［15］Melnik BC.Role of FGFR2-signaling in the pathogenesis of acne［J］.Dermatoendocrinol,2009,1（3）:141-156.

［16］Purpura V1,Belleudi F,Caputo S,et al.HPV16 E5 and KGFR/FGFR2b interplay in differentiating epithelial cells ［J］.Oncotarget,2013,4（2）:192-205.

［17］de Giorgi V,Sestini S,Massi D,et al.Keratinocyte growth factor receptors［J］.Dermatol Clin,2007,25（4）:477-485.