新型維A酸ECPIRM及全反式維A酸對白細胞介素17刺激HaCaT細胞白細胞介素1β表達的影響

楊林芳 曹玉萍 張孟麗 馬鵬程 李玲珺 魏峻 陶蕾 劉維達

維A酸是維生素A類衍生物，利用其抗炎作用，治療包括銀屑病在內的多種慢性炎癥性皮膚病。本課題組合成的新型維A酸類藥物derivativeN-（4-ethoxycarbonylphenyl）isoretinamide（ECPIRM，已申請專利，專利號：201310219734.4）主要通過非受體激活途徑，在發揮其抗炎作用的同時減輕臨床不良反應。白細胞介素1（IL-1）家族在免疫調節和炎癥過程中扮演重要角色，在銀屑病等炎癥性皮膚病中表達量升高［1］。角質形成細胞在調節炎癥過程中起重要作用，Th17細胞的產物IL-17刺激角質形成細胞IL-1β上調，加重皮膚炎癥［2］。本研究通過觀察IL-17對HaCaT細胞分泌IL-1β的干預作用，探討IL-17對HaCaT細胞IL-1β表達的影響，以及ECPIRM及ATRA對IL-17誘導的HaCaT細胞IL-1β表達的干預作用。

材料與方法

一、材料

永生化人角質形成細胞株HaCaT細胞（本實驗室保存），ECPIRM（本課題組合成），IL-17（美國Peprotech公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），MTT（美國Sigma-Aldrich公司），Trizol（美國 Life Technologies公司），SYBR green實時熒光定量PCR檢測試劑盒（大連TaKaRa公司），人IL-1β定量ELISA試劑盒（聯科生物技術有限公司），全波長酶標儀（美國Thermo公司），GeneAmp PCR System 9700（美國 ABI公司）熒光定量PCR儀（美國ABI）。

（1）通風：是豬舍降溫放熱的有效措施，即可排除舍內的熱量，又能改善空氣污濁度，保持舍內空氣新鮮。實際生產中要依據舍內空氣質量和溫濕度的情況，適時通風換氣。

二、方法

為了與原方案對比，仍采用原來的刀盤網格模型，用原先的單元尺寸對異形刀片重新劃分網格，并和刀盤網格模型組合后形成優化方案3的CFD模型。設置相同的邊界條件，待流場穩定后測得一個旋轉周期內刀片上的扭矩，如圖14所示。

ECPIRM對HaCaT細胞的抑制生長作用具有濃度及時間依賴性（表2）。24 h時，低濃度ECPIRM（20、40 μmol/L）對HaCaT細胞具有促進增殖的作用，80 μmol/L ECPIRM對HaCaT細胞生長沒有影響；隨著ECPIRM濃度增高，抑制HaCaT細胞生長。48 h 時，ECPIRM（20、40 μmol/L）對 HaCaT 細胞生長沒有影響，隨著濃度升高出現抑制。72 h時，各濃度ECPIRM均抑制HaCaT細胞生長。以下實驗選擇80 μmol/L ECPIRM。

寧夏十年九旱，是我國極度干旱缺水的地區之一。多年平均降水量289 mm，蒸發量1 250 mm。當地水資源量少質差、時空分布不均。全區水資源總量11.63億m3，其中地表水資源量9.49億m3。經濟社會發展主要依賴于國家限量分配的黃河水，全區水資源可利用量41.5億m3，人均占有量687m3，不足全國平均值的1/3。按自然地理特點、經濟狀況，全區大體分為北部引黃灌區、中部干旱帶和南部山區。

5.RT-PCR檢測IL-1β mRNA相對表達水平：采用Trizol法提取HaCaT細胞總RNA，測定純度并定量后反轉錄合成第1鏈cDNA，進行RT-PCR反應。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IL-β 上游引物 5′-TTACAGTGGCAATGAGGATGA C-3′，下游引物 5′-GTGGTGGTCGGAGATTCGTA-3′；內參照β肌動蛋白上游引物5′-TAGTTGCGTTACA CCCTTTCTTG-3′，下游引物 5′-TCACCTTCACCGT TCCAGTTT-3′，反應條件：預變性 95 ℃ 10 min，變性 95℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，循環數 40。采用 2-ΔΔCt法，ΔCt= 目的基因 Ct值 - β 肌動蛋白Ct值；ΔΔCt=樣品ΔCt-對照樣品ΔCt。以對照組目的基因表達量為1，2-△△Ct值即為實驗組目的基因較對照組目的基因表達的倍數。

當時，火鍋的質地有陶瓷、純銀、銀鍍金、銅、錫、鐵數種。其基本形式有兩種：一種為組合式，由鍋、爐支架、爐圈、爐盤、酒精碗5部分組成，可以同時上桌燒煮食物，也可單獨用鍋溫食品。另一種為鍋中帶爐，爐內燒炭火，能把水燒開，生魚、生肉、蔬菜等放入沸水中可以煮熟。

3.MTT法檢測細胞增殖活性：96孔板中各組細胞培養完畢后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃避光孵育4 h后棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩儀上低速振蕩10 min。酶標儀490 nm處測定各孔A值。

二、ECPIRM對IL-17刺激HaCaT細胞IL-1β蛋白表達的影響

結 果

一、MTT法檢測不同藥物濃度對HaCaT細胞增殖活力的影響

ATRA對HaCaT細胞具有抑制生長的作用，并有濃度及時間依賴性（表 1），其中 1 μmol/L 及 5 μmol/LATRA作用24 h對細胞增殖沒有影響，以下實驗選擇 5 μmol/L ATRA。

1.細胞培養：HaCaT細胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基中，37℃5%CO2條件下培養，待細胞單層鋪滿培養瓶以后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待鏡下細胞呈圓形時加DMEM培養基終止消化，細胞收集于離心管中，40×g離心4 min，棄上清液，重懸于DMEM細胞培養基中，傳代培養。

表1 不同濃度全反式維A酸（ATRA）對HaCaT細胞增殖活力的影響（A值，±s）

表1 不同濃度全反式維A酸（ATRA）對HaCaT細胞增殖活力的影響（A值，±s）

注：n=5。與對照組相比，a：P ＜ 0.05

2 4 h 4 8 h 7 2 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）對照組 0.5 4 5±0.0 0 6 - 0.8 5 5±0.0 2 0 - 1.5 1 2±0.0 2 0 -1 μ m o l/L A T R A 0.5 4 4±0.0 0 8 0.2 3 0.8 2 2±0.0 6 0 a 4.4 1 1.3 0 9±0.0 2 0 a 1 4.3 6 5 μ m o l/L A T R A 0.5 4 3±0.0 0 5 1.4 8 0.7 8 7±0.0 1 0 a 8.8 4 1.2 4 3±0.0 2 0 a 1 9.9 2 1 0 μ m o l/L A T R A 0.5 2 9±0.0 0 8 a 4.4 5 0.7 5 1±0.0 2 0 a 1 4.6 3 1.1 9 3±0.0 1 0 a 2 3.3 9 5 0 μ m o l/L A T R A 0.4 7 2±0.0 0 7 a 1 7.0 3 0.6 2 6±0.0 2 0 a 2 9.7 9 1.0 3 2±0.0 6 0 a 3 5.7 3 1 0 0 μ m o l/L A T R A 0.4 0 6±0.0 0 3 a 3 1.2 8 0.5 5 3±0.0 3 0 a 3 9.3 4 0.8 9 8±0.0 3 0 a 4 3.2 3 F值 3 9.3 5 1 9.7 1 2 0.0 4 P值 ＜0.0 5 ＜0.0 5 ＜0.0 5組別

表2 不同濃度新型維A酸ECPIRM對HaCaT細胞增殖活力的影響（A值，±s）

表2 不同濃度新型維A酸ECPIRM對HaCaT細胞增殖活力的影響（A值，±s）

注：n=5。與對照組相比，a：P ＜ 0.05

2 4 h 4 8 h 7 2 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）對照組 0.5 6 9±0.0 1 4 - 0.8 1 7±0.0 2 0 - 1.3 1 2±0.0 1 0 -2 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 8 2±0.0 0 3 a -3.1 0 0.8 2 0±0.0 2 0 0.3 3 1.1 8 8±0.0 3 0 a 1 0.1 8 4 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 8 4±0.0 0 3 a -3.9 1 0.8 1 8±0.0 2 0 0.0 6 0.9 2 9±0.0 2 0 a 3 1.2 9 8 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 6 8±0.0 0 9 0.4 6 0.7 6 3±0.0 3 0 7.4 1 0.6 6 1±0.0 3 0 a 5 3.1 4 1 6 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 2 3±0.0 0 2 a 9.6 1 0.4 4 1±0.0 2 0 a 5 1.5 4 0.3 0 2±0.0 3 0 a 8 2.5 4 3 2 0 μ m o l/L E C P I R M 0.3 6 1±0.0 0 9 a 4 3.3 5 0.1 5 1±0.0 2 0 a 9 1.2 7 0.1 8 3±0.0 1 0 a 9 3.2 3 F值 5 7.1 4 7 4.6 7 7 7.3 6 P值 ＜0.0 5 ＜0.0 5 ＜0.0 5組別

2.實驗分組：MTT實驗分為ECPIRM組、ATRA組、IL-17組、ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17組。不同濃度 ECPIRM 組（20、40、80、160、320μmol/L）及 ATRA 組（1、5、10、50、100 μmol/L）分別作用 24、48 及 72h，IL-17（20μg/L）組作用 24h，IL-17（20μg/L）+ECPIRM（80 μmol/L）組作用 24 h，IL-17（20 μg/L）+ATRA（5 μmol/L）組作用 24 h，同時設對照組（加等量的IL-17溶解液）。24 h后收集細胞培養上清液并提取細胞總RNA進行下一步實驗。

80μmol/L ECPIRM及5μmol/LATRA與20μg/L IL-17作用于HaCaT細胞后，對照組、IL-17組、ATAR+IL-17組、ECPIRM+IL-17組細胞增殖活力（A值）分別為1.312±0.011、1.316±0.014、1.297±0.024、1.230 ± 0.014，經單因素方差分析，F=1.702，差異無統計學意義（P＞0.05）。

4.IL-1β的含量測定：離心收集各組細胞培養上清液，用IL-1β ELISA試劑盒檢測，按照說明書步驟操作，實驗完成后用酶標儀測定A值，根據測定結果制作標準曲線，計算出各組樣品中IL-1β含量。

是的，是有過。因為我和男朋友一次吵架，他失手推倒我，孩子沒出生就夭折。那個時候我脾氣暴戾，我們為了小事就可以大打出手，過后又會互相乞求對方原諒，糾纏著愛著生活著，并想著永遠。男朋友在我們相處的第三個年頭得了脊柱結核，動完手術之后癱瘓在床，醫生說他有可能這輩子都站不起來，我照顧了他兩年，有好轉的跡象，腿已經能活動，就在我們歡歡喜喜準備出院的前一天，他用水果刀刺穿了自己的心臟。是因為已經能夠活動的腿突然又喪失了知覺。他再也忍受不了這樣的屈辱，所以，拋棄了親人，放棄了愛人。

見表3。與對照組比較，IL-17可上調HaCaT細胞分泌IL-1β蛋白的水平，差異有統計學意義（P＜0.05）；ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17組 IL-1β蛋白的表達下降，與IL-17組相比差異均有統計學意義（P＜0.05）；對照組與ECPIRM+IL-17組及ATRA+IL-17組之間差異無統計學意義。

幾何教學的目的在于系統地研究平面上和空間物體圖形的性質，并利用這些性質去解決計算題和作圖題；在于發展學生的邏輯的思維和對于空間的想象力，并使他們能運用所學到的知識去解決實際問題：在當地進行測量，測定各種建筑物的面積和容積，作應用于軍事方面的簡單測量等等.

表3 ECPIRM、ATRA及IL-17對HaCaT細胞IL-1β蛋白及mRNA表達的影響（±s）

表3 ECPIRM、ATRA及IL-17對HaCaT細胞IL-1β蛋白及mRNA表達的影響（±s）

注：n=3。ECPIRM：新型維A酸；ATRA：全反式維A酸；IL-17：白細胞介素17。a：與IL-17組相比，P＜0.05；b：與對照組相比，P＜0.05；c：與ECPIRM及ATRA干預組相比，P＜0.05

組別I L-1 β（n g/L）I L-1 β m R N A（2-△△Ct）對照組 1 1.4 2 7±0.9 2 9 a 1.0 0±0.0 3 a I L-1 7組 2 0.3 1 2±2.0 5 3 bc 4.0 5±0.4 7 bc E C P I R M+I L-1 7組 1 2.4 7 0±1.8 9 7 a 0.8 2±0.1 2 a A T R A+I L-1 7組 1 2.6 9 4±1.4 7 8 a 0.8 7±0.1 8 a F值 2 4.6 8 2 1.0 1 P值 ＜0.0 5 ＜0.0 5

三、ECPIRM對IL-17刺激HaCaT細胞IL-1β mRNA表達的影響

見表3。IL-17組與對照組比較，HaCaT細胞IL-1β mRNA表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17 組 IL-1β mRNA表達下降，與IL-17組相比差異均有統計學意義（P＜0.05）；對照組、ECPIRM+IL-17組及ATRA+IL-17組間差異無統計學意義。

討 論

角質形成細胞是皮膚炎癥性疾病如銀屑病發病過程中重要的一環，它可通過產生多種細胞因子和化學因子而發揮作用。IL-1β在皮膚炎癥性疾病的致病中發揮重要作用［3］，包括銀屑病、特應性皮炎［4-5］等。有報道將IL-1β拮抗劑gevokizumab應用于泛發型膿皰性銀屑病取得較好療效［6］。Th17細胞與銀屑病、特應性皮炎等慢性皮膚炎癥性疾病的發病密切相關［7］，IL-17是Th17細胞分泌的細胞因子，參與銀屑病的致病過程并參與角質形成細胞的多種細胞因子的產生，它可以通過上調促炎介質、中性粒細胞趨化因子和炎癥趨化因子，活化T細胞跨越胞外域參與機體炎癥反應［8］。

維A酸通過調節天然免疫和T細胞等免疫細胞的功能，抑制各種炎癥因子釋放，參與機體的炎癥活動［9］。有報道全反式維A酸ATRA在炎癥發生時對穩定人類天然調節性T細胞起到關鍵作用，通過抑制人類天然調節性T細胞向Th1和（或）Th17細胞轉化，抑制IL-1和IL-6配體功能發揮作用，成為一種控制免疫介導的慢性自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療方向［10］。本實驗結果提示，ATRA可抑制由IL-17刺激誘導的HaCaT細胞IL-1β的表達。維A酸通過與HaCaT細胞表面的維A酸受體（RAR、RXR）結合引發系列生物學效應［11］，ATRA 通過激活RAR抑制炎癥環境中炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌［12］。另有實驗報道，9-cis-RA通過與RXR結合抑制由高糖引起的人類臍靜脈內皮細胞的細胞間黏附分子1（ICAM-1）及血管細胞間黏附分子1（VCAM-1）的產生［13］。另一方面維A酸受體的表達及激活與臨床不良反應相關，為了減少不良反應的發生，我們嘗試應用非受體激活的新型維A酸衍生物來探究其影響及作用機制。ECIRM是以13-cis-RA為原料合成，前期研究表明，其作用過程中對RAR和RXR均無明顯的激活作用［14］。提示除了受體依賴途徑外，維A酸尚能通過非受體依賴途徑抑制炎癥因子的產生，發揮抗炎作用。本研究中，根據MTT實驗結果我們選擇對HaCaT細胞生長無影響的ECPIRM及ATRA藥物濃度。結果提示，IL-17可促進HaCaT細胞分泌IL-1β，ECPIRM及ATRA均可以抑制由IL-17誘導的HaCaT細胞IL-1β的表達。上述結果可為多種慢性炎癥性皮膚病提供新的治療思路和理論依據，但更深入詳盡的作用機制仍待進一步的實驗驗證。

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