中藥黃檗對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌效果的初步研究

趙凌旭，王蕾

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032)

中藥黃檗對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌效果的初步研究

趙凌旭，王蕾

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032)

目的研究中藥黃檗對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果。方法采用瓊脂稀釋法、常量肉湯稀釋法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)黃檗水煎劑對(duì)20株金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果瓊脂稀釋法抑制90%菌株生長(zhǎng)的MIC(MIC90)為12.5 mg/mL，常量肉湯稀釋法MIC90為25 mg/mL，微量肉湯稀釋法MIC90為25 mg/mL。結(jié)論中藥黃檗對(duì)金黃色葡萄球菌在體外有較好的抑菌效果。

黃檗;金黃色葡萄球菌;體外抑菌

黃檗是蕓香科植物黃皮樹(shù)及黃柏樹(shù)除去栓皮的干燥樹(shù)皮，其性味苦寒，入腎、膀胱、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、清虛熱的作用［1］。臨床上，黃檗常作為清熱利濕熏洗劑的一味中藥之一，其對(duì)包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等均具有一定的抑菌作用［2］。有研究表明，黃檗中主要的抗菌成分是小檗堿，但其還含有巴馬亭、藥根堿、黃柏堿和黃柏酮等其他一些抗菌成分［3］。我們采用3種不同的藥物體外抑菌試驗(yàn)檢測(cè)黃檗水煎劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，觀察黃檗抗菌成分的聯(lián)合抗菌作用。

材料和方法

一、材料

1.菌株來(lái)源選取20株金黃色葡萄球菌，其中包含1株藥物敏感性質(zhì)控菌株——金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)，其余19株分離自臨床膿液樣本，經(jīng)VITEK 2 Compact系統(tǒng)鑒定均為非耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

2.試劑與儀器黃檗、水解酪蛋白胨肉湯(美國(guó)Oxide公司)、水解酪蛋白胨瓊脂(美國(guó)Oxide公司)、高壓滅菌鍋、微量加樣槍和比色儀等。

二、方法

1.黃檗水煎劑的制備用傳統(tǒng)煎煮法將黃檗制成單味水煎劑［4］。制法:將100 g黃檗略粉碎后置于燒杯中，加水200 mL加熱煮沸30 min，過(guò)濾后將藥渣再加水100 m L加熱煮沸30 min，合并2次煎液后過(guò)濾，再將濾液加熱濃縮至200 mL，其生藥濃度為500 mg/mL，表示每毫升水煎劑中相當(dāng)于含黃檗生藥500 mg，裝瓶4℃冷藏備用［5］。

2.菌液的制備取20株金黃色葡萄球菌分別接種于水解酪蛋白胨平板，置35℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌接種環(huán)挑取菌落，生理鹽水校正至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋奂s為(0.1～0.2)×1012cfu/L］，再用肉湯1∶10稀釋成含菌量為(1～2)×107cfu/mL的菌液。

3.瓊脂稀釋法抑菌試驗(yàn)將黃檗水煎劑用無(wú)菌水稀釋成9個(gè)濃度梯度(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91和1.95 mg/mL)的藥液。取36 g水解酪蛋白胨瓊脂粉加1 L無(wú)菌水置于合適的玻璃瓶中，121℃高壓滅菌15 min。將各濃度的藥液2和18 mL高壓后的水解酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基混勻傾注平板，制備成含黃檗濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391和0.019 mg/mL的瓊脂平板，冷卻待用，另取不含藥液的水解酪蛋白胨平板做無(wú)菌對(duì)照和細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照［6］。取菌液2 μL接種于平板，置35℃溫箱培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。檢查無(wú)菌對(duì)照平板不長(zhǎng)細(xì)菌，生長(zhǎng)對(duì)照平板長(zhǎng)菌證明試驗(yàn)有效，藥物最低濃度平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者即為受試菌的最低抑菌濃度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

4.常量肉湯稀釋法抑菌試驗(yàn)按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將黃檗水煎劑用肉湯稀釋成200 mg/mL備用。取11支高壓滅菌玻璃試管排成一列，每管加入2 mL水解酪蛋白胨肉湯，在第1管中加入稀釋后的黃檗水煎劑2 mL混勻，然后吸取2 mL至第2管，混勻后吸取2 mL至第3管，依次類(lèi)推。第9管吸取2 mL棄去。此時(shí)各管的藥物濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781和0.391 mg/mL。第10管為不加藥液的受試菌對(duì)照管，第11管為不加藥液的無(wú)菌肉湯對(duì)照管。于1至10管中加入0.1 mL調(diào)整好的菌液，此時(shí)每管最終菌液濃度為5×105cfu/m L。置于35℃溫箱培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。檢查無(wú)菌對(duì)照管不長(zhǎng)細(xì)菌，受試菌對(duì)照管長(zhǎng)菌證明試驗(yàn)有效。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者即為受試菌的MIC。

5.微量肉湯稀釋法抑菌試驗(yàn)此方法由常量肉湯稀釋法改進(jìn)而來(lái)。按上述方法制備10個(gè)濃度梯度的培養(yǎng)基。取無(wú)菌96孔U型板，將配制好的含藥培養(yǎng)基200 μL分別加入一排孔中，使每一排的濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391和0 g/m L。第10孔為不加藥液的受試菌對(duì)照管，第11孔為不加藥液的無(wú)菌肉湯對(duì)照管。第1至10孔中加入調(diào)整好的菌液10 μL，此時(shí)每孔含菌最終濃度為5× 105cfu/mL。同時(shí)設(shè)第1列為空白孔。接種后的U型板以第1列為空白孔調(diào)零，以600 nm測(cè)定各孔初始吸光度(A)值3次求得平均值作為本底。置于35℃溫箱培養(yǎng)18 h后再次測(cè)定其A值3次并求平均值。培養(yǎng)后測(cè)定的A值減去同濃度的本底A值即為試驗(yàn)微孔的A凈值，根據(jù)凈值判斷MIC。根據(jù)計(jì)算，A凈值＞0.02視為有菌生長(zhǎng)。

結(jié)果

一、瓊脂稀釋法抑菌試驗(yàn)

20株金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果顯示，黃檗水煎液在6.25 mg/mL濃度時(shí)累積抑菌率為40%，12.5 mg/mL濃度時(shí)累積抑菌率為100%，故抑制90%菌株生長(zhǎng)的MIC(MIC90)為12.5 mg/mL。見(jiàn)表1。

二、常量肉湯稀釋法抑菌試驗(yàn)

20株金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果顯示，黃檗水煎液在12.5 mg/mL濃度時(shí)累積抑菌率為40%，25 mg/mL濃度時(shí)累積抑菌率為100%，故MIC90為25 mg/m L。見(jiàn)表1。

表1 瓊脂稀釋法和常量肉湯稀釋法檢測(cè)黃檗對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值(mg/mL)

三、微量肉湯稀釋法抑菌試驗(yàn)

20株金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果顯示，黃檗水煎液在12.5 mg/mL濃度時(shí)累積抑菌率為45%， 25 mg/mL濃度時(shí)累積抑菌率為100%，故MIC90為25 mg/mL。見(jiàn)表2。

表2 微量肉湯稀釋法檢測(cè)黃檗對(duì)金黃色葡萄球菌的A凈值

討論

金黃色葡萄球菌是化膿性感染中最常見(jiàn)的致病菌之一［7］，可引起人類(lèi)局部化膿性感染，如癰、癤等。近年來(lái)，隨著合成及半合成抗菌藥物的增多和廣泛使用，臨床上金黃色葡萄球菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重［8］。中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，藥源廣泛，價(jià)格低廉，含有多種活性成分，具有廣譜抗菌作用，在動(dòng)物體內(nèi)不易產(chǎn)生耐藥性，尤其在一些慢性感染過(guò)程中和急性感染的后期使用中草藥不僅能抗菌消炎，還具有全面的調(diào)理作用［9］。黃檗作為中醫(yī)外科復(fù)方熏洗劑的一味中藥之一，其具有廣譜的抗菌作用。本研究借鑒細(xì)菌體外藥物敏感性試驗(yàn)方法，對(duì)黃檗水煎劑進(jìn)行抗金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，黃檗含有多種廣譜抗菌成分，主要成分為小檗堿(又稱(chēng)黃連素)，而其他生物堿成分如巴馬亭、黃柏堿也具有相同的基本分子骨架，即原小檗堿類(lèi)生物堿分子骨架和芳型季錢(qián)氮結(jié)構(gòu)，抑菌譜理論上不會(huì)產(chǎn)生較大差異［10］。小檗堿屬異喹啉類(lèi)生物堿，有研究發(fā)現(xiàn)其能夠穿透磷脂雙分子膜和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，是一種穿透性陽(yáng)離子和多藥耐藥泵作用物［11］。原小檗堿立體結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)結(jié)構(gòu)疊合較好，作用機(jī)制有相似之處，可能通過(guò)抑制細(xì)菌核蛋白體30S亞基或DNA回旋酶A產(chǎn)生抑菌作用［12］。周樹(shù)勤等［13］研究表明，小檗堿能使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的自溶酶條帶增強(qiáng)，自溶酶譜增寬，提示小檗堿可能激活金黃色葡萄球菌的自溶酶系統(tǒng)，使自溶酶表達(dá)增加，或使自溶酶水解細(xì)胞壁的活性增強(qiáng)，這可能為小檗堿用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的治療提供理論依據(jù)。

體外抑菌結(jié)果顯示，黃檗水煎液在25 mg/mL的生藥濃度下即可抑制所有試驗(yàn)菌株，提示其在體外具有較強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌的能力。進(jìn)一步比較3種方法，常量肉湯稀釋法和微量肉湯稀釋法測(cè)定的MIC90值要高于瓊脂稀釋法，這可能與細(xì)菌的培養(yǎng)環(huán)境(液體和固體培養(yǎng)基)有關(guān)，也有可能與中藥的作用方式(細(xì)菌與藥液直接接觸，細(xì)菌與含藥瓊脂表面接觸)有關(guān)，需做進(jìn)一步試驗(yàn)。瓊脂平板稀釋法結(jié)果直觀、易判斷且容易發(fā)現(xiàn)污染菌，但含藥瓊脂培養(yǎng)基制作比較復(fù)雜、耗時(shí)，臨床實(shí)驗(yàn)室不易推廣。常量肉湯稀釋法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定中藥抑菌效果比較常用的方法，操作簡(jiǎn)單，但由于部分中藥水煎劑本身具有比較深的底色，對(duì)結(jié)果判斷有一定的干擾。微量肉湯稀釋法利用U型板代替玻璃管，同時(shí)利用比色儀代替肉眼觀察，方法簡(jiǎn)單且判斷方便，結(jié)果與常量肉湯稀釋法一致，可以作為臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定中藥抑菌效果的方法。郭麗雙等［14］研究表明，采用微量肉湯稀釋法在不同時(shí)間段測(cè)定A值，可以繪制細(xì)菌在不同藥物濃度下的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)，提示中藥不同成分對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的不同作用。

本研究采用的體外抑菌試驗(yàn)表明，黃檗在體外對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，這為黃檗治療金黃色葡萄球菌感染提供了一種新的探索。但中藥受體外和體內(nèi)作用環(huán)境不同的影響，抑菌結(jié)果并不完全一致。因此本研究所得單味黃檗水煎劑對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC90值僅為體外抑菌效果，不足以闡明其對(duì)整個(gè)機(jī)體的影響，并不能完全反映其在體內(nèi)的藥物濃度和抗菌作用，這也是目前單味中藥體外抑菌試驗(yàn)的局限性。

［1］張義虎，孫靜.黃柏的臨床應(yīng)用總述［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7(3):182-183.

［2］李峰，賈彥竹.黃柏的臨床藥理作用［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2004，16(2):191.

［3］王躍華，徐文俊，何俊蓉，等.川黃柏離體培養(yǎng)及藥用成分的抑菌試驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29(10):1002-1003.

［4］夏美玲，呂麗艷，劉野，等.5種中草藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)的研究［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30 (24):3024-3025.

［5］張景皓，李艷紅，趙虎.五味子對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌體外殺菌和抑菌作用的研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，29 (6):664-667.

［6］王秀華，李仲興，張新華，等.五倍子等14種中藥對(duì)112株表皮葡萄球菌的抗菌活性觀察［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(4):275-277.

［7］徐紅云，劉春林，李宜錚，等.傷口感染病原菌分布及耐藥譜分析［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25 (11):1313-1316.

［8］胡仁靜，嚴(yán)子禾，胡錫池.金黃色葡萄球菌的耐藥分析［J］.職業(yè)與健康，2009，25(24):2859-2860.

［9］李娟，李曉東，楊麗霞，等.單味中藥體外抑菌活性的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17 (11):283-286.

［10］楊勇，葉小利，李學(xué)剛.4種黃連生物堿的抑菌作用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(12):3013-3014.

［11］SEVERINAⅡ，MUNTYAN MS，LEWIS K，et al.Transfer of cationic antibacterial agents berberine，palmatine，and benzalkonium through bimolecular planar phospholipid film and Staphylococcus aureus membrane［J］.IUBMB Life，2001，52(6):321-324.

［12］李波，朱維良，陳凱先.小檗堿及其衍生物的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(8):773-787.

［13］周樹(shù)勤，姚芬，黃源春，等.小檗堿對(duì)MRSA自溶酶系統(tǒng)作用的研究［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2012，12(4):310-312.

［14］郭麗雙，葛立男，宋寶輝，等.中藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法的比較［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，27(10):1207-1208.

Primary investigation on in vitro bacteriostatic action of Amur-cork tree to Staphylococcus aureus

ZHAO Lingxu，WANG Lei.(Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China)

ObjectiveTo investigate in vitro bacteriostatic action of Amur-corktree to Staphylococcus aureus.MethodsThe minimum inhibitory concentrations(MIC)of Amur-corktree to 20 isolates of Staphylococcus aureus were determined by agar dilution method，normal dilution method and micro-dilution method.ResultsThe MIC for inhibiting 90%bacteria(MIC90)of agar dilution method was 12.5 mg/mL，the MIC90 of normal dilution method was 25 mg/mL，and the MIC90 of micro-dilution method was 25 mg/mL.ConclusionsIt exists an obvious in vitro bacteriostatic action of Amur-corktree to Staphylococcus aureus.

Amur-corktree;Staphylococcus aureus;In vitro bacteriestasis

1673-8640(2015)09-0886-04

R378.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.005

2014-12-19)

(本文編輯:姜敏)

趙凌旭，男，1986年生，學(xué)士，技師，主要從事微生物檢驗(yàn)工作。

王蕾，聯(lián)系電話(huà):021-64385700。