不同處理方法對流式細胞術檢測外周血單核細胞-血小板聚集體的影響

李琳蕓，梅冰，王昌富

(華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院檢驗科，湖北荊州434020)

不同處理方法對流式細胞術檢測外周血單核細胞-血小板聚集體的影響

李琳蕓，梅冰，王昌富

(華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院檢驗科，湖北荊州434020)

目的探討實際工作中不同處理方法對流式細胞術檢測單核細胞-血小板聚集體(MPA)的影響，為準確檢測MPA提供依據。方法獲取枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈全血，分別以CD14-藻紅蛋白(PE)、CD61-異硫氰酸熒光素(FITC)標記單核細胞、血小板，以CD62P-PE標記活化血小板，使用流式細胞術檢測CD14-PE/CD61-FITC雙陽性MPA占單核細胞百分比及血小板CD62P陽性率。采用不同處理方法［全血標本處理前后放置不同時間、全血固定后立即標記抗體或放置不同時間后標記抗體、抗體標記前全血離心處理、不同抗體組合(抗CD14-PE和抗CD61-FITC，抗CD14-PE和抗CD41-ECD，抗CD45-ECD和抗CD61-FITC)］檢測MPA，比較各種處理方法檢測的MPA是否有差異。結果與獲取標本后立即處理比較，放置于室溫(18～25℃)和低溫(2～8℃)，MPA百分比、血小板CD62P陽性率均隨放置時間的延長而增加(P＜0.05)，兩者呈正相關(室溫r=0.82，P＜0.05;低溫r=0.83，P＜0.05)。標本處理后立即檢測或低溫保存放置至24 h再檢測，MPA百分率差異無統計學意義(P＞0.05)。與固定前標記抗體的處理方法比較，1%多聚甲醛低溫固定全血標本后標記抗體，或者低溫保存放置至24 h再標記抗體，MPA百分率差異無統計學意義(P＞0.05)。全血標本離心處理后，MPA百分率和血小板CD62P陽性率均明顯增加(P＜0.05)。不同的抗體組合檢測MPA百分比的差異均無統計學意義(P均＞0.05)。結論獲取全血標本后應盡快處理，不能立即處理的應使用固定劑固定后可低溫保存24 h。在標記新鮮全血標本前，應避免離心，處理完畢的標本使用固定劑固定后可低溫保存24 h再用流式細胞術檢測。不同抗體組合應驗證后使用，CD14/CD61、CD14/CD41、CD45/CD61組合均適用于檢測MPA。

單核細胞-血小板聚集體;流式細胞術;處理方法

在多種疾病中，包括外周血管疾病、高血壓、冠狀動脈綜合癥、糖尿病等，循環中的血小板活化均可增加。這些血小板能結合各種類型的白細胞，其中最受關注的是單核細胞［1］。多種分子相互結合介導單核細胞-血小板聚集體(monocyteplatelet aggregation，MPA)的形成，其中活化血小板表面表達的P-選擇素(CD62P)與組成性表達于單核細胞的配體P-選擇素受體-1(P-selectin glucoligand-1，PSGL-1)是介導MPA形成的主要分子［1］。MPA的出現及其水平的高低與疾病的急慢性、嚴重程度、治療效果等方面有相關性［3］。研究顯示，體內活化血小板表面的CD62P數小時內被剪切掉，而MPA可更長時間的保留在外周血中［4］，能更長時間的提示血小板活化。因此，檢測MPA具有重要的臨床價值。流式細胞術是檢測MPA簡便、有效的方法。由于血液離體后的保存放置、不同處理方式等均有可能導致血小板體外活化，從而影響MPA的檢測結果。因此，我們探討了實際工作中不同處理方法對流式細胞術檢測MPA的影響，為準確檢測MPA提供依據。

材料和方法

一、標本來源

來自華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院門診隨機抽取的新鮮枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血。

二、儀器與試劑

美國Beckman-Coulter公司EPICS XL流式細胞儀。OptiLyse溶血劑(含1.5%甲醛)，熒光標記單克隆抗體CD14-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、CD61-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、CD62P-PE、CD41-ECD、CD45-ECD以及同型對照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-ECD均購自美國Beckman-Coulter公司。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.2～7.4)、1%多聚甲醛依據文獻［5］由本實驗室自行配制。

三、方法

1.MPA檢測抽血時前2 mL血棄去，獲取枸櫞酸鈉抗凝全血標本，立即如下處理:(1)溫和顛倒混勻，取每管50 μL，共2管;(2)每管加如下抗體，對照管加IgG1-FITC 10 μL、CD14-PE 10μL，檢測管加CD14-PE 10 μL、CD61-FITC 10 μL，溫和混勻，室溫(18～25℃)孵育15～20 min;(3)加含1.5%甲醛的OptiLyse溶血劑500 μL，溫和混勻，室溫放置10 min;(4)加PBS 3 mL，混勻，300×g離心5 min，去上清，適量PBS重懸沉淀，上機檢測。以CD14-PE標記單核細胞，以CD61-FITC標記血小板，以CD14-PE/CD61-FITC雙陽性為MPA，計數至少1 000個單核細胞，記錄MPA數量占總單核細胞數的百分比。

2.血小板活化標志物CD62P的檢測與MPA檢測使用同一標本。取每管5 μL，加PBS 40 μL，共2管。(1)標記抗體:對照管加CD61-FITC 10 μL、IgG1-PE 10 μL，檢測管加CD61-FITC 10 μL、CD62-PE 10 μL，溫和混勻，室溫(18～25℃)避光孵育15～20 min;(2)溶血固定:加OptiLyse溶血劑500 μL，溫和混勻，室溫放置10 min，加4 mL PBS，混勻，上機檢測。以CD61-FITC標記血小板，以CD62P-PE/CD61-FITC雙陽性為活化血小板，計數至少3 000個血小板，記錄活化血小板數量占總血小板數的百分比。

四、不同處理方法對MPA檢測結果的影響

以下5組為獨立實驗，每組均單獨隨機抽取3份不同的門診患者的新鮮枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血檢測。

1.標本處理前放置時間取2管同一患者來源的枸櫞酸鈉抗凝全血，獲取后立即處理，或分別于室溫(18～25℃)和低溫(2～8℃)放置30、60、120 min，檢測各時間點的MPA和血小板CD62P。

2.標本處理后放置時間標本處理后立即檢測或于低溫保存2、4、24 h，檢測各時間點的MPA。

3.分別于標本固定前、后標記抗體固定前標記抗體的檢測同上述檢測MPA的方法。固定后標記抗體操作如下:100 μL全血標本加入低溫預冷的1%多聚甲醛1 mL，輕輕混勻，低溫固定30 min，300×g離心5 min，去上清，加4 mL PBS洗滌1次，立即加抗體孵育，或固定后置低溫保存4及24 h，再加抗體孵育20 min。加溶血劑OptiLyse 500 μL，混勻，室溫放置10 min。PBS洗滌1次，去上清，適量PBS重懸沉淀，上機檢測MPA。

4.標記抗體前離心處理對MPA的影響全血標本600×g離心5 min后再顛倒混勻，檢測MPA和血小板CD62P。

5.不同抗體組合檢測MPA的比較采用不同抗體組合標記單核細胞和血小板。組合如下:抗CD14-PE和抗CD61-FITC，抗CD14-PE和抗CD41-ECD，抗CD45 ECD和抗CD61-FITC，操作同前述。采用不同抗體組合標記MPA，以CD14-PE標記單核細胞，分別以CD61-FITC和CD41-ECD標記血小板，以CD14-PE/CD61-FITC雙陽性、CD14-PE/ CD41-ECD雙陽性為MPA。以CD45-ECD/SSC散點圖界定單核細胞群，以CD61-FITC標記血小板，以CD45-ECD/CD61-FITC雙陽性標記MPA。

四、統計學方法

結果

一、標本處理前不同放置時間對MPA檢測的影響

標本分別于室溫(18～25℃)和低溫(2～8℃)保存放置30、60、120 min后處理的MPA檢測結果與標本立即處理的MPA檢測結果比較，差異均有統計學意義(P均＜0.05)。MPA占單核細胞的百分比、血小板CD62P陽性率均隨放置時間的延長而增高。室溫與低溫各時間點MPA百分比與血小板CD62P陽性率呈正相關(室溫r=0.82，P＜0.05;低溫r=0.83，P＜0.05)。見圖1。

圖1 標本處理前放置不同時間檢測的MPA占單核細胞的百分率和血小板CD62P陽性率

二、標本處理后不同放置時間對MPA檢測的影響

標本處理后于低溫保存2、4、24 h后再檢測MPA，其結果與處理后立即檢測比較，差異均無統計學意義(P均＞0.05)。見圖2。

圖2 標本處理前放置不同時間檢測的MPA占單核細胞百分率

三、標本固定前、后標記抗體的比較

1%多聚甲醛低溫固定全血標本后立即孵育抗體，或固定后放置于低溫保存4、24 h再孵育抗體，其MPA占單核細胞的百分率與固定前孵育抗體比較，差異均無統計學意義(P均＞0.05)。見圖3。

圖3 標本固定前、后標記抗體并檢測的MPA占單核細胞百分率

四、標本標記抗體前離心處理

與離心前標記抗體比較，全血標本離心處理后標記抗體，MPA占單核細胞的百分率和血小板CD62P陽性率均明顯增高(P＜0.05)。見圖4、圖5。

圖4 標本離心前、后MPA占單核細胞的百分率比較

五、不同抗體組合檢測的比較

分別以抗CD14-PE和抗CD61-FITC、抗CD14-PE和抗CD41-ECD、抗CD45-ECD和抗CD61-FITC標記檢測MPA。不同抗體組合之間MPA占單核細胞百分率差異均無統計學意義(P均＞0.05)。見圖6。

圖5 標本離心前、后血小板CD62P陽性率

圖6 不同抗體組合檢測MPA占單核細胞百分率的比較

討論

多種分子相互結合介導MPA的形成，其中活化血小板表面表達CD62P與組成性表達于單核細胞配體(PSGL-1)結合，兩者是介導MPA形成的主要分子［1］。研究顯示，在體內，血小板膜表面的CD62P在較短時間內被剪切掉，而循環中MPA的半衰期卻長于血小板膜表面CD62P［4］，具體機制不明確，可能與其它分子的作用(包括CD40/CD40L，GP-Ⅰb/CD11b等)有關。因此檢測外周血的MPA水平能更穩定地反映血小板活化［4］。

離體之后的外周血使用枸櫞酸鈉抗凝可抑制血小板的進一步活化。在實際檢測工作中，標本獲取后可能不能立即處理。本研究結果顯示，全血標本離體后不論是放置在室溫(18～25℃)還是低溫(2～8℃)保存，保存時間越長，血小板CD62P陽性率越高，反映出血小板活化增加。MPA的形成亦隨著保存時間延長而增加，兩者存在一定相關性。因此標本獲取后應立即處理。本研究結果還顯示血小板CD62P陽性率在2 h內升高了4倍，而MPA占單核細胞百分率的水平大約只升高了25%。因此，1個單核細胞可能結合了多個活化血小板［2］。另外，MPA與CD62P陽性血小板同時存在，也說明活化血小板并不全都結合單核細胞。因此可能導致活化血小板上升幅度高于MPA上升幅度，但兩者仍存在一定相關性。

使用多聚甲醛固定可阻止血小板的活化。對于不能立即處理的標本可以先固定，便于保存放置。本研究結果顯示，使用1%多聚甲醛先于低溫固定標本處理，可有效抑制血小板的體外活化。可保存至次日再孵育抗體，MPA占單核細胞百分比未發生明顯變化。

新鮮全血處理過程中，在孵育抗體后使用含有1.5%甲醛的溶血劑固定，可以一方面阻止血小板體外活化，另一方面也便于檢測前的保存。本研究結果顯示，將標記處理完畢之后的標本放置于低溫可保存至次日再上機檢測。在固定之前應避免離心，離心過程中的剪切力可能導致血小板活化［6］。本研究結果還顯示，離心處理可導致血小板活化增加，MPA形成亦增加。

單核細胞標記物一般使用CD14標記，血小板標記常用的有CD41、CD61等。本研究結果顯示，CD14/CD61、CD14/CD41抗體組合之間MPA檢測結果差異無統計學意義(P＞0.05)。CD45是泛白細胞標記物，CD45/SSC散點圖可將淋巴細胞、單核細胞、粒細胞三群更清楚的區分開來，通過在CD45/SSC散點圖對單核細胞設門，同時使用CD61標記血小板，這種抗體組合同樣可以檢測MPA，結果與CD14/CD61、CD14/CD41抗體組合比較無明顯差異。此外，該方法可同時檢測粒細胞-血小板聚集體。因此實驗室可根據實際已有或者可獲取的熒光標記抗體，來選擇適合的抗體組合。

綜上所述，實驗室在獲取全血標本后應盡快處理，不能立即處理的應使用固定劑固定，固定后可低溫保存24 h，固定前應避免離心，處理完畢的標本使用固定劑固定后可低溫保存24 h再檢測，不同抗體組合應驗證后使用，CD14/CD61、CD14/ CD41、CD45/CD61組合均適用于檢測MPA。

［1］VAN GILS JM，ZWAGINGA JJ，HORDIJK PL.Molecular and functional interactions among monocytes，platelets，and endothelial cells and their relevance for cardiovascular diseases［J］.J Leukoc Biol，2009，85(2):195-204.

［2］SARMA J，LAAN CA，ALAM S，et al.Increased p latelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes［J］.Circulation，2002，105 (18):2166-2171.

［3］耿朝暉，郭竹英，胡曉波，等.血小板活化標志物:血小板與單核細胞聚合物的臨床應用［J］.檢驗醫學，2011，26(6):419-421.

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［5］吳麗娟.臨床流式細胞學檢驗技術［M］.北京:人民軍醫出版社，2010:308-309.

［6］PERNEBY C，WALLéN NH，HU H，et al.Prothrombotic responses to exercise are little influenced by clopidogrel treatment［J］.Thromb Res，2004，114(4):235-243.

In fluence of different processing techniques on peripheral blood monocyte-platelet aggregation by flow cytometry

LI Linyun，MEI Bing，WANG Changfu.(Department of Clinical Laboratory，Jingzhou Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Technology，Hubei Jingzhou 434020，China)

ObjectiveTo investigate the influence of different processing techniques on monocyte-platelet aggregation(MPA)by flow cytometry in order to provide the reference for the determ ination of MPA.MethodsSodium citrate anticoagulation whole blood samp les were collected random ly.CD14-phycoerythrin(PE)and CD61-fluorescein isothiocyanate(FITC)were used to label monocytes and platelets.CD62P-PE was used to label activated platelets.The percentages of CD14-PE/CD61-FITC-double-positive MPA in monocytes and CD62P-positive platelets were determined by flow cytometry.Different processing techniques were performed as follows.Whole blood samples were prepared immediately after collection or delayed for different times.After preparation，samples were analyzed immediately or delayed for different times.Antibody immunolabeling was performed before fixation of whole blood samples，immediately after fixation or at different delayed times after fixation.Before immunolabeling，whole blood samples were centrifugated or not.Different antibodies，anti-CD14-PE with anti-CD61-FITC，anti-CD14-PE with anti-CD41-ECD and anti-CD45-ECD with anti-CD61-FITC，were used to label MPA.The results of MPA from different processing techniques were compared.ResultsCompared with immediate preparation after blood collection，the percentages of MPA and CD62P-positive platelets increased with the delayed time at room temperature(18-25℃)and low temperature(2-8℃)(P＜0.05)，and there was a positive correlation(room temperature:r=0.82，P＜0.05;low temperature:r=0.83，P＜0.05).Compared with immediate determination after preparation，the percentages of MPA of samples stored at low temperature for 24h after preparation did not alter significantly(P＞0.05).Compared with immunolabeling samples before fixation with 1%paraformaldehyde，no significant change was observed in MPA percentages from immediate immunolabeling after fixation or immunolabeling samples stored at low temperature for 24 h after fixation(P＞0.05).Centrifugation of whole blood samples before immunolabeling resulted in significant increase of the percentages of MPA and CD62P-positive platelets(P＜0.05).MPA percentages resulted from different antibodies had no significant variance (P＞0.05).ConclusionsWhole blood samples should be handled as soon as possible.Fixation with 1% paraformaldehyde at low temperature could store samp les for 24h before handling.Centrifugation should be avoided before immunolabeling.A fter preparation and fixation，samples could be stored at low temperature for 24h before analysis.Different antibody combinations，including anti-CD14-PE/anti-CD61-FITC，anti-CD14-PE/anti-CD41-ECD and anti-CD45-ECD/anti-CD61-FITC，are all suitable for immunolabeling MPA.

Monocyte-platelet aggregation;Flow cytometry;Processing

1673-8640(2015)09-0916-05

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.012

2014-11-06)

(本文編輯:范基農)

湖北省衛生廳科研一般項目(JX5B47)

李琳蕓，女，1980年生，碩士，主管技師，主要從事臨床流式細胞術檢測和應用研究。

王昌富，聯系電話:0716-8436074。