真菌(1，3)-β-D-葡聚糖多克隆抗體制備及ELISA競爭法檢測體系的建立

嚴俊，楊葳，翟栓柱，薛知信，郁彭，周澤奇

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457;2.天津市醫療器械技術審評中心，天津300070)

真菌(1，3)-β-D-葡聚糖多克隆抗體制備及ELISA競爭法檢測體系的建立

嚴俊1，楊葳2，翟栓柱1，薛知信1，郁彭1，周澤奇1

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457;2.天津市醫療器械技術審評中心，天津300070)

目的建立高特異性和敏感性的(1，3)-β-D-葡聚糖酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測體系。方法經蛋白修飾的(1，3)-β-D-葡聚糖和真菌提取物作為免疫原制備兔多克隆抗體，并對高效價交叉反應弱的抗體進行純化和辣根過氧化物酶(HRP)標記，最后建立真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系。結果建立的ELISA競爭法檢測體系線性范圍為3.125～200 pg/mL。添加100、25和6.25 pg/mL抗原的血清回收率為97.8%～113.6%，重復試驗的變異系數＜15%。該檢測體系能有效地從血清樣本中檢出低濃度的煙曲霉、白念珠菌和高濃度的隱球菌，并且對結核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌和金黃色葡萄球菌5種細菌抗干擾能力強。結論利用(1，3)-β-D-葡聚糖作為包被抗原，酶標抗體HRP-Ab3B作為檢測抗體，成功建立了(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系。

(1，3)-β-D-葡聚糖;酶聯免疫吸附試驗;侵襲性真菌病

現代移植醫學的發展、獲得性免疫缺陷綜合征等多種因素使低免疫人群增多，侵襲性真菌感染的發生率迅速增長。侵襲性真菌感染癥狀無特異性，診斷困難，有效治療時間短，死亡率高。建立特異、快速、敏感的侵襲性真菌病檢測方法是臨床診療的需要。常用的鱟試劑檢測(1，3)-β-D-葡聚糖的試驗條件苛刻，假陽性因素過多(包括內毒素污染、溶血和部分抗腫瘤藥物等)且不能檢出隱球菌和毛霉菌等［1-3］。酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術成熟，成本相對較低，診斷快速，便于臨床實驗室使用。因此，建立真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA檢測體系具有十分重要的臨床應用價值。

材料和方法

一、材料

1.試驗動物雄性新西蘭兔(約2 kg/只)，由天津國際生物醫藥聯合研究院提供和飼養。

2.抗原和菌種海帶多糖、茯苓多糖、凝膠多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖和隱球菌莢膜多糖由丹娜(天津)生物科技有限公司提供，曲霉菌種由北京協和醫院提供。

3.主要試劑牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)購自上海生工生物工程有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔IgG購自Abbkine公司，其它試劑購自Sigma公司。

4.主要儀器SPECTRAMAX 190酶標儀購自Molecular Devices公司，1260 Infinity高效液相色譜儀購自Agilent公司，?KTA蛋白純化系統FPLC購自Amersham Biosciences公司。

二、方法

1.免疫原制備(1，3)-β-D-葡聚糖免疫原制備:使用過碘酸鹽氧化法［4］和DMTMM試劑法［5］對(1，3)-β-D-葡聚糖(包括海帶多糖、茯苓多糖和凝膠多糖等)進行BSA修飾。煙曲霉菌體和孢子免疫原制備:煙曲霉經液體30℃200 r/min搖床振蕩培養48 h后過濾收集菌體［6］。用3.7%甲醛滅活，生理鹽水洗滌。倒入液氮研磨破碎，收集上清液。煙曲霉經30℃平皿固體培養72 h后洗脫收集孢子。用3.7%甲醛滅活，生理鹽水洗滌。用血球板法計數，超聲波破碎，獲得孢子破碎液。

2.動物免疫將免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化后對新西蘭兔進行皮下多點注射。再次免疫改用弗氏不完全佐劑。第3次免疫后，每隔1周進行耳動脈采血，測定抗血清效價。當免疫后效價不再升高時，頸動脈放血，分離抗血清。

3.間接法測定效價用磷酸鹽緩沖液稀釋抗原作為包被液，在4℃包被過夜后棄去，洗液洗滌3次，封閉液封閉。用磷酸鹽緩沖液梯度稀釋抗血清/多克隆抗體后加到酶標板上，37℃孵育1 h，洗板后加入HRP標記的羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30 min，洗板后加入四甲基聯苯胺底物，37℃顯色15 min后終止。測定450 nm吸光度(A450nm)值。將A450nm值在0.4～0.6之間的抗血清/多克隆抗體的稀釋倍數作為其效價。

4.多克隆抗體和HRP標記抗血清先依次用50%和33%飽和硫酸銨鹽析，再用瓊脂糖凝膠Protein A親和層析，獲得高純度的多克隆抗體［7］。最后用十二烷基磺酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳進行鑒定。

用過碘酸鹽氧化法對抗體Ab-3B進行HRP標記。再用?KTA蛋白純化儀分離純化并實時檢測A280nm值，收集第1個蛋白峰，命名為酶標抗體HRP-Ab3B。

5.真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法體系酶標板包被:用磷酸鹽緩沖液稀釋的(1，3)-β-D-葡聚糖作為包被液，37℃過夜包被，洗板后用封閉液封閉。樣本處理:取300 μL血清樣本，加入100 μL乙二胺四乙酸二鈉處理液，振蕩混勻，沸水浴3 min，10 000×g離心10 min。競爭法檢測:酶標板上依次加入50 μL抗原標準品［(1， 3)-β-D-葡聚糖濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.563 pg/mL］或處理后樣本上清液，再加入50 μL適當濃度的酶標抗體HRPAb3B，混勻后37℃孵育60 min，洗板后加四甲基聯苯胺底物溶液，37℃顯色15 min后終止。測定A450nm值。

6.ELISA競爭法體系性能驗證(1)線性: ELISA競爭法重復檢測3次，計算線性相關系數; (2)檢測限:將Tris-HCl樣本稀釋液作為樣本，重復檢測20次，用文獻［8］的方法計算檢測限;(3)回收率和重復性:用加100、25和6.25 pg/mL凝膠多糖的3種正常人血清作為樣本，用處理液處理后重復檢測10次;(4)交叉反應:將8種病原菌(結核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、煙曲霉、白念珠菌和隱球菌)干粉添加到健康人血清中并進行梯度稀釋，樣本經同樣的方法處理后進行檢測，觀察非真菌抗原是否出現假陽性。

結果

一、抗血清效價和交叉試驗

采集全血后分離的血清，用茯苓多糖、凝膠多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隱球菌莢膜多糖包被酶標板使用間接法進行檢測。抗血清效價超過16 000的兔子有11只(除去與其它真菌多糖抗原存在嚴重交叉反應的3只)。其中(1，3)-β-D-葡聚糖免疫獲得抗血清效價高，且與其它抗原交叉反應弱。選擇其中效價最高的1B、2C、3B和6A的兔血清進行純化。

二、多克隆抗體Ab-3B電泳鑒定

抗血清純化的抗體中，Ab-3B效價最高，效價為16 000。對其進行電泳鑒定。根據Marker條帶遷移率可知，抗體Ab-3B蛋白帶的相對分子質量為50 000和25 000，與抗體輕鏈和重鏈的相對分子質量完全一致，且無其它雜蛋白條帶。由此證明，純化后抗體Ab-3B中無其它雜蛋白。見圖1。

圖1 多克隆抗體Ab-3B電泳圖

三、ELISA競爭法檢測體系驗證

建立的ELISA競爭法檢測體系的線性范圍為3.125～200 pg/mL;重復檢測3次，曲線擬合方程的r2值均＞0.98，見圖2;檢測限為2.130 pg/mL;含高、中和低濃度(100、25和6.25 pg/mL)抗原血清檢測到濃度值依次為(97.80±9.53)、(26.50± 3.71)、(7.10±0.98)pg/mL，回收率為97.8%～113.6%，變異系數均＜15%;含10 μg/m L細菌病原菌(結核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌和金黃色葡萄球菌)干粉的血清均無法檢出(1，3)-β-D-葡聚糖，3種常見的真菌病原菌(低濃度的煙曲霉、白念球菌和高濃度的隱球菌)均能檢測到(1，3)-β-D-葡聚糖。見表1。

圖2 ELISA競爭法的標準曲線驗證

表1 菌體干粉添加到血清ELISA競爭法檢測結果對比(pg/mL)

討論

本研究創新利用修飾的(1，3)-β-D-葡聚糖作為包被抗原，酶標抗體HRP-Ab3B作為檢測抗體，成功建立了(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系。試驗中使用的抗體Ab-3B具有很高的特異性，避免與其它真菌多糖的交叉反應。該檢測體系不僅能從血清中檢出低濃度的曲霉和白念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖，而且可以檢測高濃度的隱球菌(1，3)-β-D-葡聚糖，與5種臨床常見病原菌(結核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌和金黃色葡萄球菌)無交叉反應。此外，本檢測體系敏感性高，檢測限為2.130 pg/m L，檢測時間短，2 h內完成檢測，提高了目前臨床上(1，3)-β-D-葡聚糖鱟試劑檢測方法的特異性。

本研究的創新點是把原來非特異性的鱟試驗檢測方法改變為特異性的ELISA檢測方法，類似研究未見報道。原鱟試驗方法特異性較差，內毒素污染、多糖類藥物等都會使其呈假陽性，無法檢測溶血、高脂、黃疸、渾濁等特殊樣本。ELISA檢測體系使用免疫學原理，因此不存在內毒素的干擾，溶血或其他特殊樣本經處理液處理后也能正常檢測。由此可見，相對于鱟試劑，ELISA具有明顯優勢。

本研究雖然建立了真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系，但是該體系的性能還需要進一步評估。如果該檢測體系能成功應用于臨床診斷，必將大大提高(1，3)-β-D-葡聚糖檢測的特異性，降低對檢測人員技術和實驗室檢測環境的要求，實現準確、簡便、快捷診斷侵襲性真菌病。

［1］GULLO A.Invasive fungal infections:the challenge continues［J］.Drugs，2009，69(Suppl 1):65-73.

［2］SHEN YZ，QI TK，MA JX，et al.Invasive fungal infections among inpatients with acquired immune deficiency syndrome at a Chinese university hospital［J］.Mycoses，2007，50(6):475-480.

［3］王端禮.醫學真菌學:實驗室檢驗指南［M］.北京:人民衛生出版社，2005:120-122.

［4］HOUDE M，GOTTSCHALK M，GAGNON F，et al.Streptococcus suiscapsular polysaccharide inhibits phagocytosis through destabilization of lipid microdomains and prevents lactosylceramide-dependent recognition［J］.Infect Immun，2012，80(2):506-517.

［5］SCHLOTTMANN SA，JAIN N，CHIRMULE N，et al.A novel chemistry for conjugating pneumococcal polysaccharides to Lum inex microspheres［J］.J ImmunolMethods，2006，309(1-2):75-85.

［6］HAO W，PAN YX，DING YQ，et al.Well-characterized monoclonal antibodies against cell wall antigen of Aspergillus species improve immunoassay specificity and sensitivity［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15(2):194-202.

［7］黎燕，健男，紀巖.分子免疫學實驗指南［M］.北京:化學工業出版社，2008:29-42.

［8］全國醫用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統標準化技術委員會.YY/T 1183-2010酶聯免疫吸附法檢測試劑(盒)［S］.北京:中國標準出版社，2010.

Preparation of polyclonal antibody and development of a com petitive ELISA for fungal(1，3)-beta-D-glucan

YAN Jun1，YANG Wei2，ZHAI Shuanzhu1，XUE Zhixin1，YU Peng1，ZHOU Zeqi1.(1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2.Tianjin Medical Instrument Technical Evaluation Center，Tianjin 300070，China)

ObjectiveTo develop a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)with high specificity and sensitivity for fungal(1，3)-beta-D-glucan.MethodsRabbit polyclonal antibody was produced by immunization with protein-conjugated(1，3)-beta-D-glucan and fungal extract.The highest titer and little crossreactivity polyclonal antibody was labeled with horseradish peroxidase(HRP)and purified.Finally，a competitive ELISA was established for fungal(1，3)-beta-D-glucan.ResultsThe linear range was 3.125-200 pg/mL.The recovery range for 100，25 and 6.25 pg/mL serum antigen was 97.8%-113.6%，and the coefficient of variation for repeated test was＜15%.The detection system could effectively detect low concentrations ofAspergillus fumigatusandCandida albicansand high concentration ofCryptococcus neoformansfrom serum samples.Meanwhile，the detection system demonstrated little interference against 5 kinds of pathogenic bacteria，includingMycobacterium tuberculosis，Escherichia coli，Salmonella，KlebsiellaandStaphylococcus aureus.ConclusionsA competitive ELISA is developed successfully for the detection of invasive fungal disease with(1，3)-beta-D-glucan used as a coated antigen and enzymelabeled antibody HRP-Ab3B used as a detection antibody.

(1，3)-beta-D-glucan;Enzyme-linked immunosorbent assay;Invasive fungal disease

1673-8640(2015)09-0931-03

R446.61

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.015

2015-02-25)

(本文編輯:姜敏)

嚴俊，男，1987年生，碩士，主要從事臨床微生物疾病早期診斷研究。