地奧心血康抗炎鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)研究

李 翔， 于 婭， 黃飛鴻， 熊 晏， 李奇娟， 瞿禮萍， 鄒文俊

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都610075）

地奧心血康抗炎鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)研究

李 翔， 于 婭， 黃飛鴻， 熊 晏， 李奇娟， 瞿禮萍， 鄒文俊*

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都610075）

目的研究地奧心血康 （黃山藥、穿龍薯蕷）的抗炎鎮(zhèn)痛作用。方法采用福爾馬林致小鼠疼痛反應(yīng)模型、二甲苯致小鼠耳腫脹模型、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型、棉球致小鼠肉芽腫模型和角叉菜膠致小鼠氣囊炎癥模型觀察地奧心血康的抗炎鎮(zhèn)痛作用；采用酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）硝酸還原法測(cè)定氣囊炎癥模型小鼠氣囊灌洗液中腫瘤壞死因子 （TNF-α）和一氧化氮 （NO）水平，采用硫代巴比妥酸 （TBA）法和水溶性的四唑鹽法 （WST-1）測(cè)定模型小鼠血清中丙二醛 （MDA）和超氧化物歧化酶 （SOD）水平，分析其可能的抗炎機(jī)制。結(jié)果地奧心血康80 mg/kg、60 mg/kg能顯著減少福爾馬林致痛模型小鼠15～35 min的舔后足累計(jì)時(shí)間（P＜0.05），能明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高、棉球致小鼠肉芽組織增生以及角叉菜膠致氣囊炎癥模型小鼠的炎癥反應(yīng)（P＜0.01或P＜0.05）；并能降低氣囊炎癥模型小鼠炎性滲出液中NO、TNF-α水平，減少血清中MDA水平，提高SOD活力（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論地奧心血康的抗炎作用可能與抑制炎性因子NO、TNF-α及抗氧化有關(guān)。

地奧心血康；抗炎；鎮(zhèn)痛；硫代巴比妥酸 （TBA）法

地奧心血康是地奧心血康膠囊的原料藥，收載于 《中國(guó)藥典》2010年版一部，為薯蕷科植物黃山藥Dioscorea panthaica Prain et Burkill、穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino的根莖提取物［1］。地奧心血康膠囊是心血管領(lǐng)域中成藥制劑，長(zhǎng)期廣泛用于治療冠心病、心絞痛等心血管疾病，臨床療效顯著。地奧心血康原料藥材穿龍薯蕷具有 “祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)”的傳統(tǒng)功效，民間應(yīng)用于治療風(fēng)濕痹痛、肢體麻木、跌打損傷、癰腫等癥［2-5］。近年來(lái)已有研究表明，穿龍薯蕷提取物具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用［6-9］。然而，尚未見(jiàn)地奧心血康抗炎鎮(zhèn)痛作用相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用多種炎癥和疼痛動(dòng)物模型，觀察地奧心血康的抗炎鎮(zhèn)痛作用以及對(duì)炎癥相關(guān)因子的影響，以初步闡明地奧心血康抗炎鎮(zhèn)痛作用及可能的作用機(jī)制，為拓展地奧心血康的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 地奧心血康 （棕色粉末，由成都地奧制藥集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)20121227）；阿司匹林腸溶片 （拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ08550）；二甲苯 （批號(hào)20110604）、冰醋酸 （批號(hào)20091008）、甲醛 （批號(hào)20120927）均由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。Evans Blue（Sigma公司，批號(hào)1001699862）；λ-角叉菜膠 （Sigma公司，批號(hào)17H1148）；SOD、MDA、NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；TNF-α試劑盒（RayBio公司，GA30092）。

1.2 動(dòng)物 KM小鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號(hào)scxk（川）2013-24。動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度 （23±1）℃，相對(duì)濕度 （60±5）%，人工光照，12 h明暗周期交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.3 儀器 Sorvall ST-16R離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀 （美國(guó)Thermo公司）；BS323S電子天平（Sartorius公司）；101C-2電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）。

2 方法

2.1 抗炎實(shí)驗(yàn)

2.1.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 取健康雄性KM小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為模型組、阿司匹林組 （300 mg/kg）、地奧心血康高、中、低劑量組 （80、60、40 mg/kg）。連續(xù)灌胃給藥5 d，每天1次，模型組給予等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，各組小鼠末次給藥1 h后，用20μL二甲苯均勻涂抹于每只小鼠右耳前后兩側(cè)致炎，致炎后30 min處死小鼠，用直徑6 mm小鼠耳片打孔器分別打下左右兩耳同一部位，稱定質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算小鼠耳腫脹度及耳腫脹抑制率。

耳腫脹度（mg）=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量；

耳腫脹抑制率（%）=［（對(duì)照組耳腫脹度-給藥組耳腫脹度）/對(duì)照組耳腫脹度］×100%。

2.1.2 對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響 取健康雄性KM小鼠60只，分組及給藥方法同 “2.1.1”項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，各組小鼠末次給藥1 h后，尾靜脈注射1%伊文思蘭溶液0.1 mL/10 g體質(zhì)量，同時(shí)腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只，于注射20 min后處死小鼠，用4 mL生理鹽水沖洗腹腔，收集腹腔洗液，3 000 r/min離心15min，吸取上清液于590 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值反映小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的改變。

2.1.3 對(duì)棉球致小鼠肉芽腫的影響 取健康雄性KM小鼠60只，小鼠左下肢皮膚用75%酒精消毒后用鑷子將棉球［（10±1）mg，高壓滅菌，硫酸慶大霉素加無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)濕］沿皮下植入右上肢腹股溝處，用碘伏對(duì)傷口進(jìn)行消毒。植入棉球后第2天小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為5組，每組12只，分組方法同 “2.1.1”項(xiàng)，連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，各組小鼠末次給藥1 h后，處死小鼠，解剖取出帶肉芽組織的棉球，電子天平精密稱取其質(zhì)量 （濕質(zhì)量），減去棉球的質(zhì)量 （10 mg）后得到濕肉芽組織凈質(zhì)量，然后將肉芽組織置于80℃的烘箱中4 h，稱定，計(jì)算肉芽腫干質(zhì)量及抑制率。

肉芽腫干質(zhì)量（g）=烘干棉球質(zhì)量-0.01 g；

抑制率 （%）=［（模型組肉芽腫干質(zhì)量-給藥組肉芽腫干質(zhì)量）/模型組肉芽腫干質(zhì)量］×100%。

2.1.4 對(duì)角叉菜膠致小鼠氣囊炎癥模型的影響取健康雄性KM小鼠72只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為空白組、模型組、阿司匹林組 （300 mg/kg）、地奧心血康高、中、低劑量組 （80、60、40 mg/kg）。第1天給藥前于小鼠背部肩胛區(qū)皮下無(wú)菌注入空氣5 mL形成氣囊，連續(xù)給藥7 d，第4天和第6天補(bǔ)充注射空氣3mL維持氣囊膨脹，末次給藥1 h后除正常組外其他小鼠在氣囊內(nèi)注入1%角叉菜膠1 ML，立即將鼠背向下徐徐轉(zhuǎn)動(dòng)，正常組囊內(nèi)注入等容量生理鹽水。致炎6 h后小鼠眼眶取血，3 000 r/min低速離心10min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法和水溶性的四唑鹽（water-soluble tetrazoliuMsalt，WST-1）測(cè)定SOD、MDA水平；用75%酒精消毒背部皮膚，剪開(kāi)氣囊，以PBS緩沖液4 ML灌洗氣囊，收集灌洗液并測(cè)量體積，加細(xì)胞稀釋液后對(duì)其中白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；將灌洗液3 000 r/min低速離心10 min，收集上清液，2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定上清液中總蛋白量，用硝酸還原法檢測(cè)NO量，ELISA法檢測(cè)TNF-α量。

2.2 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)對(duì)福爾馬林致小鼠疼痛反應(yīng)模型的影響 取健康雄性KM小鼠60只，分組及給藥方法同 “2.1.1”項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，各組小鼠末次給藥1 h后，將小鼠提前30 min放入燒杯中適應(yīng)環(huán)境，在小鼠右后足跖部皮下注射5%福爾馬林溶液20μL并計(jì)時(shí)，立即將小鼠單只放入直徑20 cm的大燒杯內(nèi)，記錄Ⅰ相神經(jīng)疼痛期 （0～5 min）和Ⅱ相炎性疼痛期 （15～35 min）小鼠舔右后足的累計(jì)時(shí)間。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法 各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS 17.0單因素方差分析（One-Way ANOVA），不符合者采用非參數(shù)檢驗(yàn)秩和法分析。

3 結(jié)果

3.1 抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與模型組比較，阿司匹林組和地奧心血康80、60 mg/kg劑量組能顯著降低二甲苯所致小鼠耳腫脹度 （P＜0.01或P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；低劑量組40 mg/kg有一定的作用趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

3.1.2 對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

與模型組比較，地奧心血康80、60 mg/kg劑量組能明顯降低腹腔灌洗液OD值 （P＜0.05），地奧心血康40 mg/kg劑量有一定的作用趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表1 地奧心血康對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)的影響 （x± s，n=12）Tab.1 Effect of DAXXK on Mice ear swelling caused byxy lene（x±s，n=12）

表2 地奧心血康對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 （x± s，n=12）Tab.2 Effect of DAXXK on Mice’s capillary permeability in abdoMinal cavity increased by acetic acid（x± s，n=12）

3.1.3 對(duì)小鼠棉球肉芽腫的影響 與模型組比較，地奧心血康80 mg/kg劑量組可顯著降低棉球誘導(dǎo)的肉芽腫干質(zhì)量 （P＜0.05）；地奧心血康60、40 mg/kg劑量組無(wú)顯著抑制作用。見(jiàn)表3。

表3 地奧心血康對(duì)小鼠棉球誘導(dǎo)肉芽腫實(shí)驗(yàn)的影響 （x± s，n=12）Tab.3 Effect of DAXXK on Mice granuloma induced w ithcotton pellet（x±s，n=12）

3.1.4 對(duì)角叉菜膠致小鼠氣囊炎滲出液中白細(xì)胞和總蛋白的影響 與空白組比較，模型組炎性滲出液中總蛋白和白細(xì)胞數(shù)目明顯增多 （P＜0.05）。與模型組比較，地奧心血康80、60 mg/kg劑量組可顯著降低小鼠炎性滲出液中總蛋白含有量和白細(xì)胞數(shù)目（P＜0.05），地奧心血康40 mg/kg劑量組無(wú)明顯作用。見(jiàn)表4。

表4 地奧心血康對(duì)小鼠炎性滲出液中總蛋白和白細(xì)胞的影響（x±s，n=12）Tab.4 Effect of DAXXK on total protein and WBC on inflammation induced by carrageenan in theMice air pouch model（x±s，n=12）

3.1.5 對(duì)角叉菜膠致小鼠氣囊炎炎癥因子及SOD、MDA的影響 與空白組比較，模型組炎性滲出液中NO和TNF-α水平明顯增高，血清中MDA水平顯著增高，SOD活力明顯下降 （P＜0.05）。與模型組比較，地奧心血康80 mg/kg劑量組可顯著降低氣囊炎小鼠炎性滲出液中NO水平，地奧心血康80、60 mg/kg劑量組可顯著降低炎性滲出液中TNF-α的水平，同時(shí)可降低模型小鼠血清中MDA水平，提高SOD活力 （P＜0.05）。見(jiàn)表5。

3.2 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型組比較，地奧心血康80、60 mg/kg劑量組能顯著減少福爾馬林致痛模型小鼠15～35 min的舔后足累計(jì)時(shí)間 （P＜0.05），阿司匹林組及地奧心血康各劑量組均對(duì)0～5 min舔后足累計(jì)時(shí)間無(wú)明顯影響。見(jiàn)表6。

表5 地奧心血康對(duì)小鼠氣囊炎炎癥因子及SOD、MDA的影響（x±s，n=12）Tab.5 E ffect of DAXXK on inflammatory cytokines and SOD、MDA on inflammation induced by carrageenan in theMice air pouch exudates（x±s，n=12）

表6 地奧心血康對(duì)福爾馬林致小鼠疼痛的影響 （x±s，n=12）Tab.6 Effect of DAXXK on Mice pain induced by formalin（x±s，n=12）

4 討論

地奧心血康膠囊是1989年國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)上市的心血管領(lǐng)域中成藥，該產(chǎn)品上市20多年來(lái)，已有大量基礎(chǔ)及臨床研究表明，地奧心血康具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、減慢心率、降低血壓和外周阻力、降低心肌耗氧量、降低血液TC和TG水平、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制血小板聚集、降低血液黏度等多方面的心血管相關(guān)藥理作用和臨床療效［10-11］。本研究探討并初步確認(rèn)了地奧心血康在抗炎鎮(zhèn)痛方面的藥理活性，為該產(chǎn)品拓展與抗炎鎮(zhèn)痛作用相關(guān)的臨床新適應(yīng)癥提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹和醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高兩種急性炎癥模型，角叉菜膠致小鼠氣囊炎亞急性炎癥模型和小鼠棉球肉芽腫慢性炎癥模型，觀察地奧心血康的抗炎作用；選擇福爾馬林致痛小鼠模型觀察地奧心血康的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，地奧心血康80 mg/kg、60 mg/kg劑量組具有顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高、棉球致小鼠肉芽組織增生以及角叉菜膠致氣囊炎癥模型小鼠的炎癥反應(yīng)的作用，表明地奧心血康對(duì)急性非特異性炎癥和慢性炎癥均有良好抑制作用；同時(shí)地奧心血康80、60 mg/kg劑量組能顯著縮短福爾馬林致痛模型小鼠Ⅱ相炎性疼痛期 （15～35 min）舔足時(shí)間，而對(duì)Ⅰ相神經(jīng)疼痛期 （0～5 min）舔足時(shí)間無(wú)影響，提示地奧心血康具有較明顯抑制炎性疼痛的作用，而對(duì)神經(jīng)性疼痛無(wú)作用，該鎮(zhèn)痛作用特點(diǎn)類似非甾體抗炎藥物阿司匹林 （陽(yáng)性藥物），但其抑制炎性疼痛的作用強(qiáng)度弱于阿司匹林 （300 mg/kg）。

NO是重要的炎性因子，調(diào)控炎癥發(fā)生發(fā)展的每個(gè)關(guān)鍵步驟［12］；TNF-α是強(qiáng)有力促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)白介素和次級(jí)炎癥介質(zhì)的合成，可加重局部的炎癥反應(yīng)［13］。同時(shí)，氧自由基也是炎癥發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制之一［14］。本研究結(jié)果表明，地奧心血康能顯著降低氣囊炎小鼠炎性滲出液中NO和TNF-α水平，減少血清中MDA水平、提高SOD活力，提示地奧心血康可能通過(guò)抑制NO和TNF-α的合成和釋放發(fā)揮抗炎作用，其抗炎作用與抗氧化作用有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，小鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用有效劑量為80mg/kg、60mg/kg，地奧心血康治療心血管疾病臨床等效用量為5～10 mg/kg（地奧心血康膠囊每粒含地奧心血康100 mg，口服一次1～2粒，一日3次），地奧心血康抗炎鎮(zhèn)痛的小鼠有效劑量與該產(chǎn)品臨床治療心血管疾病人用劑量基本一致。

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Anti-inflamMatory and analgesic effects of Diao Xinxuekang

LIXiang， YU Ya， HUANG Fei-hong， XIONG Yan， LIQi-juan， QU Li-ping， ZOUWen-jun*
（School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）

AIMTo investigate the anti-inflammatory and analgesic effects of Diao Xinxuekang（Dioscorea Panthaica Prain et Burkill，Dioscorea nipponica Makino）（DAXXK）.METHODSThe anti-inflammatory and analgesic effects were performed on themice models for pain induced by formalin，of the ear swelling induced by xylene，for the capillary hyperpermeability in abdominal cavity induced by acetic acid，for the granuloma induced with cotton pellet，and for the air-pouch acute inflammation induced by carrageenan.The anti-inflammatorymechanismswere evaluated bymeasuring the levels of tumor necrosis factor（TNF-α）and nitric oxide（NO）in synovitis exudates determined by ELISA and nitrate reductase.Levels of SOD and MDA in seruMwere determined by watersoluble tetrazoliuMsalt（WST-1）and thiobarbituric acid（TBA）methods.RESULTSDAXXK（80，60 mg/kg）could reduce the cumulative time for licking hind at intervals of 15-35 min（P＜0.05）；lessen the xylene-induced ear edema，lower the capillary permeability in abdominal cavity and inhibitgranuloma，decrease the total protein contentand the amountofWBC in exudates（P＜0.01 or P＜0.05），reduce TNF-αand NO levels in exudates and MDA contents in serum，and increase SOD activity（P＜0.01 or P＜0.05）.CONCLUSIONDAXXK has remarkable anti-inflammatory and analgesic effects，which may be related to the inhibition of inflammatory cytokine NO and TNF-α，and antioxidant function.

Diao Xinxuekang（DAXXK）；anti-inflammatory；analgesic；thiobarbituric acid（TBA）method

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0934-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.002

2014-10-12

國(guó)家科技部 “十二五”重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)資助項(xiàng)目 （2012ZX09101231）

李 翔，碩士，研究方向?yàn)橹兴幣R床與應(yīng)用。Tel：15828653810，E-mail：lx1990@139.com

*通信作者：鄒文俊，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幣R床與應(yīng)用。Tel：（028）82855465，E-mail：zouwenjun@vip.163.com