丹參注射液對大鼠肝微粒體CYP450亞型酶體外抑制作用

葉 娜， 羅紅麗， 李 容， 王春燕， 楊楸楠， 萬 麗

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

丹參注射液對大鼠肝微粒體CYP450亞型酶體外抑制作用

葉 娜， 羅紅麗， 李 容， 王春燕， 楊楸楠， 萬 麗*

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

目的評價(jià)丹參注射液在體外對大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450（CYP450）亞型酶活性的影響。方法將丹參注射液分別與5種CYP450亞型酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的特異性探針底物非那西丁、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬與大鼠肝微粒體進(jìn)行孵育，采用UPLC-MS/MS法測定對應(yīng)5種代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚、4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷的含有量并計(jì)算其IC50。結(jié)果丹參注射液對CYP1A2、CYP3A4的IC50值均大于100μg/ML，對CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的IC50值分別是3.32、16.44、0.30 μg/ML。結(jié)論丹參注射液對CYP1A2、CYP3A4沒有抑制作用，但對CYP2C19和CYP2C9分別有弱和中等抑制作用，對CYP2D6表現(xiàn)出強(qiáng)抑制作用。

細(xì)胞色素P450酶；丹參注射液；大鼠肝微粒體；抑制

細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450 enzyme，CYP450）是一類以鐵卟啉為輔基的血紅素-硫醇鹽蛋白，是生物體內(nèi)參與各類外源性及內(nèi)源性物質(zhì)代謝的主要酶系［1］，其主要亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4參與市面上約90%的藥物代謝［2］，在決定藥物清除率和生物利用度等方面起著關(guān)鍵重要。因此，充分了解藥物對CYP亞型酶活性的作用，對于合理用藥，提高藥物的安全性和有效性具有重要意義；此外，在藥物研發(fā)過程中，研究主要CYP酶介導(dǎo)的代謝特性已成為發(fā)現(xiàn)和篩選有效、安全的新化合物實(shí)體的必備環(huán)節(jié)［3-4］。

中藥注射劑作為我國特有劑型，由于其成分復(fù)雜，主要還是通過藥物代謝酶進(jìn)行代謝，從而存在對代謝酶的抑制或誘導(dǎo)作用，發(fā)生藥物相互作用，因此，對中藥注射劑的體外代謝進(jìn)行研究很有必要。丹參注射液為丹參提取物制成的水溶性制劑，含丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸A及B等多種成分，其中以丹參素含有量較高［5］。由于其在心腦血管疾病方面的突出療效，臨床上與多種藥物的連用日益增多［6-9］，但丹參注射液對CYP450酶作用的研究報(bào)道相對較少，劉高峰［10］等指出丹參注射液對家兔CYP2D6有抑制作用。前期課題組對丹參注射液進(jìn)行了質(zhì)量評價(jià)研究，采用HPLC法對丹參注射液主要水溶性有效成分進(jìn)行定量測定，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明各成分線性關(guān)系良好，日內(nèi)、日間精密度均小于5%，重復(fù)性好，精密度高，其主要有效成分丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A的含有量分別是1.329 3、0.261 2、0.075 76、0.027 09 mg/mL。試驗(yàn)結(jié)果符合丹參注射液每1 mL含原兒茶酸不得少于0.2 mg的標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究采用探針?biāo)幬锓ň偷⒆⑸湟簩Υ笫蟾挝⒘ｓw 5種 CYP450亞型酶 （CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的影響進(jìn)行探討，以期為丹參注射液臨床合理聯(lián)合用藥的安全性和有效性等提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters2010型高效液相色譜儀（600泵、717自動進(jìn)樣器、996PD紫外檢測器、Waters MassLynx V4.1 Software數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；HGC-24型氮吹儀 （北京瑞邦興業(yè)科技有限公司）；Millipore純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑 丹參注射液 （批號1405010，安徽天洋藥業(yè)有限公司）；SD大鼠肝微粒體 （20 mg/mL）購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80℃冷凍保存；NADPH發(fā)生系統(tǒng)（A液、B液）購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80℃冷凍保存；非那西汀（Sigma-Aldrich公司），對乙酰氨基酚（Sigma-Aldrich公司），甲苯磺丁脲（Sigma-Aldrich公司），4-羥基甲苯磺丁脲（Toronto Research Chemicals Inc公司），奧美拉唑（Sigma-Aldrich公司），5-羥基奧美拉唑（Toronto Research Chemicals Inc公司），右美沙芬（國家藥品生物制品檢定所），右啡烷（Toronto Research Chemicals Inc公司），N-去甲右啡烷（Toronto Research Chemicals Inc公司）；地西泮對照品購自中國食品藥品檢定研究院，純度大于99.0%。甲醇、乙腈為色譜純，購自Fisher Scientifics公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 孵育體系 每個孵育體系總體積為200μL，體系包括0.1 mol的PBS緩沖液（pH=7.4）188μL，NADPH發(fā)生系統(tǒng)12μL（A液10μL；B液2μL），臨用時(shí)冰浴上混合制得。各探針底物及對應(yīng)的代謝產(chǎn)物、孵育濃度和時(shí)間如下［11-12］：非那西丁（對乙酰氨基酚，50μmol/L，30 min，CYP1A2）；甲苯磺丁脲 （4-羥基甲苯磺丁脲，100 μmol/L，30 min，CYP2C9）；奧美拉唑（5-羥基化奧美拉唑，20μmol/L，20 min，CYP2C19）；右美沙芬（右啡烷，150μmol/L，10 min，CYP2D6）；右美沙芬（N-去甲右啡烷，50μmol/L，10 min，CYP3A4）。

2.2 樣品處理 取上述孵育體系，冰浴上加入1μL的系列質(zhì)量濃度的丹參注射液 （1、10、100、1 000、10 000μg/mL）和1μL的各特異性探針底物 （空白對照樣品不加丹參注射液，只加等量溶劑），在37℃水浴中預(yù)熱5 min，冰浴上加入2μL的肝微粒體酶，輕輕混勻，根據(jù)不同的探針底物在37℃水浴中孵育10～30 min，加入4℃甲醇溶液（含內(nèi)標(biāo)地西泮20 ng/mL）1 000μL混勻終止反應(yīng)，每個樣品平行測定3次。實(shí)驗(yàn)中加入孵育體系中的藥物體積控制在1%以內(nèi)。

取終止反應(yīng)后含內(nèi)標(biāo)的肝微粒體反應(yīng)體系樣品，旋渦振蕩混勻3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液1 000μL，40℃下氮?dú)獯蹈桑鄳?yīng)的流動相100μL復(fù)溶，旋渦振蕩混勻3 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液適量，進(jìn)樣5μL，用LC-MS/MS法測定各特異性底物對應(yīng)的代謝產(chǎn)物的生成量。

優(yōu)化各代謝物的提取方法，其中對乙酰氨基酚、4-羥基甲苯磺丁脲用乙酸乙酯液-液萃取，5-羥基奧美拉唑、右啡烷和N-去甲右啡烷用甲醇萃取。

2.3 UPLC-MS/MS條件

2.3.1 色譜條件 對乙酰氨基酚、4-羥基甲苯磺丁脲、右啡烷和N-去甲右啡烷選用色譜條件為色譜柱為Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm× 50 mm，1.7μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水（65/35，V/V），體積流量0.2 mL/min；柱溫30℃；樣品室溫度10℃；運(yùn)行時(shí)間2 min；進(jìn)樣體積5μL。

5-羥基奧美拉唑色譜條件如下：Phenomenex kinetex C8色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動相為乙腈-水梯度洗脫 （0～2.5min，35%乙腈～60%乙腈）；體積流量0.2 mL/min；柱溫30℃；樣品室溫度10℃；運(yùn)行時(shí)間2.5 min；進(jìn)樣體積5μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 通過優(yōu)化選擇質(zhì)譜參數(shù)，最終確定的5種代謝物的質(zhì)譜條件結(jié)果列于表1。

表1 各代謝產(chǎn)物測定的質(zhì)譜參數(shù)及MRM檢測條件Tab.1 Mass SpectruMparameters and MRMconditions ofmetabolites

2.4 數(shù)據(jù)處理 用各模型底物的代謝物的生成速率反映微粒體孵育體系中各CYP450亞型酶的活性；設(shè)定不加丹參注射液的代謝底物的孵育體系中各同工型酶活性為100%，作為對照組；樣品組代謝物生成速率相對于對照組生成速率的百分比，作為各亞型酶的剩余活性。

剩余活性百分比=（各探針底物樣品代謝物生成速率/對照樣品代謝物生成速率）×100%。

采用SPSS statistics 17.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。對于正態(tài)分布的參數(shù)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)認(rèn)為該組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Excel對數(shù)據(jù)作圖，以丹參注射液質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，剩余酶活性百分率為縱坐標(biāo)，得到剩余酶活性百分率為50%的對應(yīng)丹參注射液質(zhì)量濃度即為IC50。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 各待測組分及內(nèi)標(biāo)的峰形及分離良好，具有較高的特異性。對乙酰氨基酚，4-羥基甲苯磺丁脲，5-羥基奧美拉唑，右啡烷，N-去甲右啡烷及內(nèi)標(biāo)地西泮的保留時(shí)間分別是1.46、1.33、2.29、1.19、1.01、1.25 min。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用上述選定的液相、質(zhì)譜條件對5種代謝物進(jìn)行定量，各代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，待測物峰面積 （A s）與內(nèi)標(biāo)峰面積（A i）的比值（A s/A i）為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得質(zhì)量濃度與響應(yīng)值的回歸方程，線性范圍如表2所示。

表2 各代謝物的線性范圍Tab.2 Linear ranges ofmetabolites

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取空白肝微粒體孵育體系，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的不同代謝產(chǎn)物，樣品處理同 “2.2”項(xiàng)下終止反應(yīng)后含內(nèi)標(biāo)的肝微粒體反應(yīng)體系樣品，即再加入4℃甲醇溶液（含內(nèi)標(biāo)地西泮20 ng/mL）1 000μL，旋渦振蕩混勻3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液1 000μL，40℃下氮?dú)獯蹈桑鄳?yīng)的流動相100 μL復(fù)溶，旋渦振蕩混勻3 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液適量，進(jìn)樣5μL，測定批內(nèi)和批間差異。結(jié)果見表3，表明低、中、高3個質(zhì)量濃度的批內(nèi)、批間精密度均小于15%，符合要求，精密度良好。

3.1.4 提取回收率 取空白肝微粒體孵育體系，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的不同代謝產(chǎn)物（對乙酰氨基酚、4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷），樣品處理同“3.1.3”項(xiàng)樣品處理方法，測定提取回收率。結(jié)果見表3，表明該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)回收率較高，準(zhǔn)確度符合要求，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可信。

表3 不同探針代謝物批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度 （x±s，n=6）Tab.3 Intra-assay precision，inter-assay precision and recovery of probemetabolites（x±s，n=6）

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白肝微粒體孵育體系，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的不同代謝產(chǎn)物（對乙酰氨基酚、4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷），樣品處理同“3.1.3”項(xiàng)，分別測定于進(jìn)樣器中放置 （4℃）24 h和-80℃冰凍放置7 d條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表4，說明各代謝產(chǎn)物于微粒體樣品中穩(wěn)定性良好。

3.1.6 基質(zhì)效應(yīng) 取空白肝微粒體孵育體系，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的不同代謝產(chǎn)物 （對乙酰氨基酚、4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、N-去甲右啡烷），樣品處理同“3.1.3”項(xiàng)樣品處理方法，與相應(yīng)濃度代謝產(chǎn)物樣品結(jié)果進(jìn)行比較，以兩者峰面積的比值來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，各組分基質(zhì)效應(yīng)的平均值在87.98%～103.03%范圍內(nèi) （表4）。

3.2 丹參注射液對大鼠CYP450酶各亞型的IC50的測定 丹參注射液對大鼠肝微粒體CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的IC50值分別為見表5，抑制曲線見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，丹參注射液對CYP1A2，CYP3A4的IC50值＞100 μg/mL，對CYP2C9，CYP2C19和CYP2D6的IC50值分別是3.32、16.44、0.30μg/mL。

表4 不同探針代謝物的穩(wěn)定性及基質(zhì)效應(yīng) （x±s，n=6）Tab.4 Stability and matrix effect of probemetabolites（x±s，n=6）

表5 丹參注射液抑制大鼠CYP450酶各亞型的IC50值Tab.5 IC50values of Danshen Injection on five specific probes of CYP450

圖1 丹參注射液對各5種大鼠CYP450亞酶活性的影響Fig.1 Effects of Danshen Injection on the activities of five rat cytochrome P450 enzymes

4 討論

酶抑制作用是代謝研究的關(guān)鍵，是預(yù)測藥物-藥物相互作用和藥物安全性評價(jià)的重要指標(biāo)。本研究建立了較為簡單快捷的分析方法，專屬性強(qiáng)，線性范圍寬，靈敏度、準(zhǔn)確度高，滿足生物樣品分析方法的一般準(zhǔn)則。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，丹參注射液對CYP1A2、CYP3A4沒有抑制作用，對CYP2C9具有中等抑制作用，對CYP2C19具有弱抑制作用，對CYP2D6表現(xiàn)出強(qiáng)抑制作用。文獻(xiàn)［13-14］報(bào)道丹參的乙醇提取物主要含脂溶性成分，丹參酮類對CYP1A2、CYP3A4/5表現(xiàn)出相應(yīng)程度的抑制作用，水溶性成分中的丹參素則是CYP2C9的中等強(qiáng)度抑制劑。丹參注射液主要是水溶性活性成分，因此對CYP1A2，CYP3A4幾乎沒有抑制作用，而對CYP2D6的強(qiáng)抑制作用與文獻(xiàn) ［10］報(bào)道結(jié)果一致。秦崇臻等［15］指出丹參多酚酸鹽能顯著抑制人CYP3A4酶活性，復(fù)方丹參片對大鼠CYP1A2活性具有一定的誘導(dǎo)作用［16］，可見，不同丹參制劑可能因?yàn)槌煞植町悓Σ煌珻YP450的影響不同。但是，由于種屬差異，人與大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致，還有待于下一步采用人肝微粒體或與人體合并用藥等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

雖然體外實(shí)驗(yàn)證明丹參注射液對大鼠CYP450酶具有一定的抑制作用，且其主要化學(xué)成分如丹參素等蛋白結(jié)合率低［17］，再者中藥復(fù)方成分復(fù)雜，所以，在臨床上與經(jīng)CYP2C9、CYP2C19，尤其是CYP2D6代謝的藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)應(yīng)特別注意。

綜上所述，本研究采用體外肝微粒體孵育體系，研究了丹參注射液對5種大鼠CYP450亞型酶的抑制作用，為預(yù)測藥物-藥物相互作用，臨床上應(yīng)用丹參注射液及含丹參成分的注射液的安全性提供了參考。

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Inhibitory effect of Danshen Injection on rats liver cytochrome P450 enzyme in vitro

YE Na， LUO Hong-li， LIRong， WANG Chun-yan， YANG Qiu-nan， WAN Li*
（School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine；Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Developmentand Utilization of ChineseMedicine Resources，Chengdu 611137，China）

cytochrome P450 enzyme；Danshen Injection；rat livermicrosome；inhibition

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0948-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.005

2014-06-19

葉 娜 （1989—），女，碩士生，從事藥物分析、中藥有效成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：13808206512，E-mail：yena310@ 126.com

*通信作者：萬 麗 （1965—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事藥物分析、中藥有效成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：5982418713，E-mail：wanli8801@163.com

日期：2014-10-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20141030.1057.001.htMl

ABSTRACT：AIMTo investigate the inhibitory effect of Danshen Injection on the activities of five rat cytochrome P450 enzymes in vitro.METHODSDanshen Injection was incubated with five specific probes（phenacetin，orinase，omeprazole，dextromethorphan，and dextrorphan）belonging to five cytochrome P450 enzymes（CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4）originated froMrat liver microsome，respectively.Their fivemetabolites（including acetaminophen，4-hydroxy tolbutamide，5-hydroxy omeprazole，dextrorphan，N-demethyl dextrorphan）were analyzed by UPLC-MS/MSassay.The IC50valueswere calculated.RESULTSDanshen Injection IC50values of CYP1A2 and CYP3A4 were more than 100μg/ML，and of CYP2C9，CYP2C19 and CYP2D6 were 3.32μg/mL，16.44μg/ML，and 0.30μg/mL，respectively.CONCLUSIONThe inhibitory effects of Danshen Injection on the activities of CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6 aremedium，weak and strong，respectively，butno effecton the activities of CYP1A2 and CYP3A4.