京大戟中大戟二烯醇的HPLC測(cè)定

葛秀允， 張樂(lè)林， 孫立立

（山東省中醫(yī)藥研究院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術(shù)與原理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014）

京大戟中大戟二烯醇的HPLC測(cè)定

葛秀允， 張樂(lè)林， 孫立立*

（山東省中醫(yī)藥研究院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術(shù)與原理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014）

目的改進(jìn)京大戟飲片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層鑒別對(duì)京大戟進(jìn)行定性鑒別。建立京大戟飲片中大戟二烯醇的HPLC定量測(cè)定方法。同時(shí)對(duì)其雜質(zhì)、水分、灰分、浸出物等進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果京大戟飲片薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好。大戟二烯醇在0.39～3.88μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r2=1.000；平均回收率為99.96%，RSD為0.97% （n=6）。結(jié)論京大戟飲片建議標(biāo)準(zhǔn)為雜質(zhì)不得過(guò)3.0%；水分不得過(guò)8.0%；總灰分不得過(guò)7.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)1.5%；浸出物含量不得低于20.0%；按干燥品計(jì)算，含大戟二烯醇 （C30H50O）不得少于0.60%。

京大戟；大戟二烯醇；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；改進(jìn)

京大戟為大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根。是臨床常用有毒中藥，具有瀉水逐飲，消腫散結(jié)的作用［1］。京大戟主要含有二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和鞣質(zhì)類(lèi)等化學(xué)成分［2-9］。具有瀉下、利尿、抗腫瘤等作用，其毒性主要表現(xiàn)在對(duì)消化系統(tǒng)具有強(qiáng)烈的刺激性作用［10-12］。自 《中國(guó)藥典》1963年版開(kāi)始收載京大戟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前尚缺乏京大戟飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致假劣京大戟飲片充斥市場(chǎng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)京大戟飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為制定京大戟飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而規(guī)范京大戟飲片的質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效［13-14］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2690型高效液相色譜儀，Waters 2010色譜工作站，德國(guó)Sartorius10-5電子天平，上海必能信B3200S-T型超聲波清洗器，硅膠G薄層預(yù)制板（青島海洋化工廠），MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)。

1.2 試藥 乙腈（HPLC，TEDIA公司出品）；磷酸、甲醇、乙酸乙酯、石油醚 （分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；大戟二烯醇對(duì)照品（euphol）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)201108，供含量測(cè)定用）。水為超純水，其他試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純。京大戟藥材購(gòu)自山東、湖北、河南、江蘇等地，經(jīng)本院中藥資源開(kāi)發(fā)研究室林惠彬研究員鑒定為大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 對(duì)收集的10批京大戟藥材分別按照《山東省中藥炮制規(guī)范》京大戟項(xiàng)下制備京大戟飲片。見(jiàn)圖1。

通過(guò)對(duì)10批京大戟飲片對(duì)比，確定京大戟形狀為：呈不規(guī)則長(zhǎng)圓形或圓形厚片。片面類(lèi)白色或淡黃色，纖維性。氣微，味微苦澀。

2.2 薄層鑒別試驗(yàn) 取本品粉末1 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大戟二烯醇對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 （附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚 （60～90℃）-乙酸乙酯 （10∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃顯色。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 10批京大戟TLC圖譜Fig.2 TLC identification of pieces of Euphorbia pekinensis

2.3 雜質(zhì)、水分、灰分、浸出物檢查 照 《中國(guó)藥典》2010年版一部雜質(zhì)檢查法 （附錄IXA）、水分測(cè)定法 （附錄ⅨH第二法）、灰分測(cè)定法 （附錄ⅨK法）對(duì)10批京大戟飲片進(jìn)行檢查，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 浸出物測(cè)定 對(duì)影響京大戟飲片浸出物量的浸出方法進(jìn)行考察。任取一批飲片，以水和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為溶劑，分別按照 《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄X A項(xiàng)下冷浸法和熱浸法步驟制備樣品，比較兩種方法浸出物的量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定熱浸法作為京大戟浸出物的測(cè)定方法。

表1 不同批次京大戟飲片 （生品）雜質(zhì)、水分、灰分和浸出物Tab.1 IMpurities，moistu re and ashes of pieces of Euphorbia pekinensis in differen t batches

采用 《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄X A項(xiàng)下熱浸法，對(duì)10批京大戟飲片進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 京大戟飲片浸出物測(cè)定結(jié)果Tab.2 Extract conten ts of pieces of Euphorbia pekinensis in different batches

2.5 大戟二烯醇測(cè)定

2.5.1 色譜條件 漢邦Benetnach C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸 （83∶17）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30℃［15-16］。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 大戟二烯醇 （自制，純度為99.21%），精密稱(chēng)取干燥至恒定質(zhì)量的大戟二烯醇對(duì)照品9.56 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻定容。精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得質(zhì)量濃度0.095 6 mg/mL的大戟二烯醇對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取京大戟飲片 （生品）干燥粉末0.5 g（過(guò)40目篩），精密稱(chēng)定，置50 ML圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 ML，閉塞，精密稱(chēng)定質(zhì)量。水浴回流提取0.5 h，及時(shí)取下，放涼后，閉塞，精密稱(chēng)量，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液2、5、10、15、20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以大戟二烯醇的進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=2×106x+14 461，相關(guān)系數(shù)r2= 1.000，大戟二烯醇在0.39～3.88μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 大戟二烯醇高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograMof refrence substance euphol

圖4 京大戟飲片HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chroMatograMof refrence piecesof Euphorbia pekinensis

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定供試品溶液中的大戟二烯醇的RSD為0.5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取京大戟飲片粉末5份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，按 “2.5.3”項(xiàng)下制備，按照 “2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得各樣品中大戟二烯醇平均含有量為7.347 mg/g，RSD為1.2%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h，按照 “2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得大戟二烯醇峰面積的RSD為0.5%，結(jié)果表明，供試品溶液至少在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 按加樣回收法，取京大戟藥材粉末6份，每份0.25 g，精密稱(chēng)定，分別加入一定量大戟二烯醇對(duì)照品，按 “2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照 “2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算大戟二烯醇的平均回收率為100.0%，RSD為1.0%。表明該測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確。

2.5.9 樣品測(cè)定 取不同批次京大戟飲片0.5 g，精密稱(chēng)定，每批樣品平行稱(chēng)取2份，按照供試品溶液制備的方法制備，每一份樣品進(jìn)樣2次進(jìn)行測(cè)定。對(duì)10個(gè)批次的京大戟飲片樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 京大戟大戟二烯醇測(cè)定結(jié)果Tab.3 DeterMination results of euphol samples

3 討論

根據(jù)10批次京大戟飲片實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，按平均值的±20%作為限度制定幅度。暫定京大戟飲片雜質(zhì)不得過(guò)雜質(zhì)不得過(guò)3.0%；水分不得過(guò)8.0%；總灰分不得過(guò)7.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)1.5%；浸出物量不得低于20.0%；按干燥品計(jì)算，含大戟二烯醇 （C30H50O）不得少于0.60%。

分別采用不同體系、不同比例的流動(dòng)相及不同色譜柱進(jìn)行色譜分離，最終確定色譜條件為：漢邦Benetnach C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-0.2%磷酸 （83∶17）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；體積流量1 ML/min；柱溫30℃。分離效果最佳。

以大戟二烯醇為對(duì)照品建立的薄層鑒別方法和HPLC定量測(cè)定方法，結(jié)果顯示，該法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、重復(fù)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于京大戟飲片中有效成分定性定量測(cè)定和質(zhì)量控制。

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Assay of euphol froMEuphorbia pekinensis

GE Xiu-yun*， ZHANG Le-lin，SUN Li-li*
（Shandong Academy of ChineseMedicine，Processing，State Key Laboratory of Processing Technology and Principleof Honey and Charcoal State Administration of TCMof P.R.China，Jinan 250014，China）

Euphorbia pekinensis Rupr.；euphol；quality standard；improvement

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1064-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.030

2014-06-09

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目 （200807039）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局名全國(guó)名老中醫(yī)藥專(zhuān)家馮寶麟傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目

葛秀允，博士，副主任中藥師，從事中藥炮制機(jī)理和工藝研究。Tel：（0531）82949829

*通信作者：孫立立，研究員，從事中藥炮制機(jī)理和中藥新藥研究。Tel：（0531）82949829，E-mail：xingerx@163.com