丹參多酚酸鹽對心衰大鼠基質金屬蛋白酶-3及其抑制因子-1表達的影響

陳 成， 鄒襄谷， 陳國通， 林秀明， 陳永忠， 陳 慧

（1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院老年科，福建福州350003；2.福建省中醫藥研究院，福建 福州350003）

丹參多酚酸鹽對心衰大鼠基質金屬蛋白酶-3及其抑制因子-1表達的影響

陳 成1， 鄒襄谷2， 陳國通2， 林秀明1， 陳永忠1， 陳 慧1

（1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院老年科，福建福州350003；2.福建省中醫藥研究院，福建 福州350003）

目的探討丹參多酚酸鹽對心衰大鼠基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）及其抑制因子-1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1）表達的影響。方法60只雄性SD大鼠完全隨機分成模型組，丹參多酚酸鹽低劑量組、高劑量組，卡托普利組，卡托普利和丹參多酚酸鹽高劑量聯合組 （簡稱中西藥聯合組），正常對照組。除正常對照組，其余大鼠運用阿霉素腹腔注射制造心衰模型，正常對照組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，每周1次，共6周。在開始造模的同時，各組開始相關干預。8周后，檢測心功能，行心肌組織天狼猩紅染色，檢測心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）、心肌血管周圍膠原面積與管腔面積的比例（perivasular circuMferentiall area，PVCA）。熒光PCR檢測心肌MMP-3、TIMP-1的mRNA水平，Western blot檢測心肌MMP-3、TIMP-1的表達情況。結果與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組均有不同程度的降低心肌CVF、PVCA（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），中西藥聯合組較卡托普利組更明顯 （P＜0.05）；丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組心肌組織中MMP-3的mRNA水平及蛋白表達較模型組均降低 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），且中西藥聯合組低于卡托普利組 （P＜0.05）；與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組均能上調心肌組織TIMP-1的mRNA水平及蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），且中西藥聯合組高于卡托普利組（P＜0.05）。結論丹參多酚酸鹽能降低心肌間質膠原，其機制可能與下調MMP-3及上調TIMP-1的表達有關。

丹參多酚酸鹽；心力衰竭；基質金屬蛋白酶-3；基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1

心衰發生發展的基本機制不僅包括心肌細胞的重構，而且還表現為細胞外基質重構，表現為心肌細胞外基質過度纖維化或降解增加，最終導致心室腔擴大、室壁變薄，導致心肌纖維化、心功能惡化。已有相關文獻證實丹參脂溶性的提取物抗心肌纖維化的作用［1-2］，丹參多酚酸鹽作為丹參水溶性的提取物，抗心肌缺血的作用已得到認可，但其對心衰大鼠心肌外基質纖維重構的影響，尚未見相關報道。本實驗從心肌膠原水平、MMP-3、TIMP-1的表達，探討丹參多酚酸鹽對心衰大鼠細胞外基質纖維化重構的影響。

1 材料

1.1 動物和分組 60只雄性SD清潔級大鼠，體質量（200±10）g，福建醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（閩）2012-0001。隨機分為6組：模型組，丹參多酚酸鹽低、高劑量組，丹參多酚酸鹽與卡托普利聯合組 （中西藥聯合組），卡托普利組，正常對照組，每組10只。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 藥物 注射用阿霉素 （鹽酸多柔比星），深圳萬樂藥業有限公司（生產批號H44024359；規格10 mg/瓶）；丹參多酚酸鹽，上海綠谷制藥有限公司 （生產批號Z20050248；規格100 mg/瓶）；卡托普利，江蘇鵬鷂藥業有限公司 （生產批號 1111221；規格 25 mg/片，100片/瓶）。

1.2.2 試劑 兔抗大鼠MMP-3多克隆抗體、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；Trizol（Invitrogen公司）；TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA第一鏈（TransGen公司）；SYBR Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG（2X）（ABI公司）；引物由福州沃森生物技術有限公司合成；其他化學分析試劑均為分析純。1.3 儀器設備 RM6240多道生理信號采集處理系統 （成都儀器廠）；ABI7500熒光定量PCR儀（北京新陽創業科技發展有限公司）；Gel DOC XR+全自動凝膠成像系統（Bio-RAD）。

2 方法

2.1 心衰模型建立 阿霉素，按3 mg/kg劑量溶于1 mL的生理鹽水，腹腔注射，第1天給予2 mg/kg，第4天起按3 mg/kg，每周1次，共6周，累計劑量達20 mg/kg。

2.2 給藥 模型組，在心衰模型的基礎上，腹腔注射生理鹽水2 mL，每天1次。丹參多酚酸鹽低、高劑量組：心衰模型基礎上，同時分別予以丹參多酚酸鹽24.219、48.438 mg/（kg·d）溶于5%葡萄糖2 mL，腹腔注射每日1次?？ㄍ衅绽M，心衰模型基礎上，每天同時予以卡托普利水溶液灌胃10 mg/（kg·d）。中西藥聯合組：心衰模型基礎上，同時予以丹參多酚酸48.438 mg/（kg·d）溶于5%葡萄糖2 mL，腹腔注射每日1次，此外每天卡托普利水溶液灌胃，10 mg/（kg·d）。正常對照組，腹腔注射生理鹽水2 mL，每天1次。上述干預連續8周。8周后，模型組、丹參多酚酸鹽低劑量組各死亡4只，丹參多酚酸鹽高劑量組死亡3只，卡托普利組及中西藥聯合組死亡2只，正常對照組沒有死亡。

2.3 心功能測定 8周后，動物5%水合氯醛4 mL/kg麻醉后，運用導管、RM6240多道生物信號采集處理系統，記錄心室壓力曲線，計算出平均心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、平均心室舒張壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVDP），平均心室內壓最大上升速率（+dP/dtmax），平均等容舒張期室內壓最大下降速率（-dP/dtmax）。上述指標，模型組與正常對照組比較有統計學差異 （P＜0.05），即心衰模型造模成功。

2.4 心肌膠原的分析 選取大鼠左室中段心肌組織10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，組織切片，行天狼猩紅染色。染色后，心肌細胞呈現黃色，間質膠原呈紅色。采用Motic Images Advanced 3.0軟件，測量心肌膠原容積分數 （%）（CVF）、心肌血管周圍膠原面積與管腔面積的比例（%）（PVCA）。其中CVF=膠原面積/總面積，PVCA =小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積。每個標本隨機取12個視野，即心肌內膜4個、心肌外膜4個、心肌小血管4個視野，進行測量，計算其平均值。

2.5 熒光PCR法檢測MMP-3、TIMP-1的mRNA水平 液氮中取心肌組織，運用Trizol試劑提取心肌總mRNA。選擇大鼠的GAPDH為內參基因，依據實時定量PCR（SYBR法）引物設計原則，設計引物 （見表1）。用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA第一鏈。SYBR的熒光定量PCR操作步驟：PCR反應液：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）10μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.4μL，PCR Reverse Primer（10 uM）0.4μL，Rox Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA template 2.0μL，滅菌蒸餾水加至20μL。選擇ABI7500PCR儀按以下程序進行定時定量PCR反應。PCR反應的程序設置為：94℃，30 s；94℃，5 s，60℃，34 s；40個循環。反應結束后進行結果分析。選取15～25個擴增循環數 （Ct）的熒光值，計算3個平行復孔的擴增效率，計算ΔΔCt【（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因）】，計算實驗組目的基因與對照組的基因的差異表達量（2-ΔΔCt=實驗組目的基因/對照組目的基因）。

表1 MMP-3、TIMP-1和GAPDH的正向引物和反向引物

2.6 Western blot檢測心肌組織MMP-3、TIMP-1的表達

依據組織質量20mg需要200μL裂解液的比例，加入2μL 100mmol/L的PMSF和198μL裂解液，使PMSF的最終濃度為1 mmol/L。玻璃勻裝器勻漿，直至充分裂解，離心，14 000×g，5 Min，小心吸取上清液分裝備用。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書操作，測定蛋白濃度，蛋白變性后備用。配置SDS—PAGE膠，用微量加樣器將樣品加于凝膠的加樣孔中，保證每樣品含蛋白50μg。插好電極，以20 V恒壓跑10 min穩定后調至60 V恒壓電泳分離 （待溴紛蘭至膠邊緣即可）。分別予以100 V恒壓50、30min，以相應Marker轉完為準，轉至PVDF膜，洗膜3次，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗均為1∶500稀釋后，在4℃孵育過夜（12～16 h），洗膜3次，于二抗 （1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜3次，加入ECL顯影成像。顯影信號的強弱用凝膠成像及分析系統分析灰度值。用目標蛋白與β-actin條帶的灰度值比值來估算目標蛋白的含有量。

2.7 數據處理 所有數據均以均數±標準差表示。檢驗方法：數據先進行正態性分布和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊性，采用單因素方差分析（ANOVA，LSD）檢驗，若正態分布但方差不齊，則采用單因素方差分析 （ANOVA，Dunnett's C）進行檢驗。若呈偏態分布者，則采用多個樣本比較的非參檢驗（Kruskal-Wallis Test），采用SPSS 19.0統計軟件進行處理，P＜0.05為有統計學意義，P＜0.01為有顯著的統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠心肌纖維的比較 心肌間質膠原染成紅色，血管周圍膠原分布較多。與正常對照組相比，模型組心肌內膜與外膜膠原CVF和PVCA明顯增高（P＜0.01）。丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組心肌CVF和PVCA較模型組明顯降低 （P＜0.05，0.01，0.01），中西藥聯合組優于卡托普利組 （P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組大鼠心肌內膜、外膜CVF和PVCA比較（%，x±s）

圖1 各組心肌天狼猩紅染色 （×100）

3.2 各組大鼠心肌MMP-3、TIMP-1的mRNA水平的比較

與正常對照組相比，模型組MMP-3的mRNA水平明顯增高 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組下調MMP-3的mRNA水平（P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯合組低于卡托普利組（P＜0.05）。與正常對照組相比，模型組TIMP-1的mRNA水平明顯降低 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組上調TIMP-1的mRNA水平 （P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯合組高于卡托普利組 （P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌MMP-3、TIMP-1的MRNA水平比較（x±s）

3.3 各組大鼠心肌MMP3、TIMP-1蛋白表達的比較 與正常對照組相比，模型組MMP-3表達明顯增高 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組下調MMP-3表達（P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯合組低于卡托普利組 （P＜0.05）。見圖2。與正常對照組相比，模型組TIMP-1的表達明顯降低 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯合組上調TIMP-1的表達（P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯合組高于卡托普利組 （P＜0.05）。見表4、圖3。

圖2 各組心肌MMP-3蛋白的表達

表4 各組大鼠心肌MMP-3、TIMP-1表達的比較（x±s）

圖3 各組心肌TIMP-1蛋白的表達

4 討論

心肌細胞外基質重構是非心肌細胞的增生及心肌細胞外基質的改建，具體表現在心肌間質膠原的增多、膠原比例的改變。MMPs與TIMPs是參與基質重構的重要因素。

MMPs是一種鋅依賴的酶家族，對細胞基質具有降解作用，能分解纖維類膠原，其家族分為間質膠原酶、明膠酶、間質溶解素及膜型MMPs等亞族，在心肌重構過程中具有重要的作用。MMP-3是MMPs中的1種，廣泛存在于多種組織和細胞中，除能降解膠原、基底膜成分外，還能激活其他種類的MMPs，引起級聯反應［3］，導致心肌膠原過度降解，膠原結構破壞，使心肌膠原重構，引起心室腔擴大、室壁變薄，促進心肌的重構及失代償期心衰的進展［4］。有研究表明，冠心病患者血清基質金屬蛋白酶3與左心室射血分數呈負相關［5］。

擴張型心肌病患者隨心功能的惡化，心肌組織MMP-3的表達及活性明顯增加。起搏誘發的慢性充血性心衰、風濕性心臟病患者，心肌組織MMP-3表達與其心功能亦呈負相關［6］。

TIMPs家族是能抑制MMPs活性的一組蛋白群，其以1∶1的比例與MMPs結合形成復合體，從而阻斷MMPs結合底物，阻礙MMPs進入膠原基質發揮作用。如果心肌組織中TIMPs下降，可使MMPs增多，引起心肌膠原降解，心腔擴大、變形，導致心室重構。TIMP-1作為TIMPs中的一員，能抑制絕大多數MMPs，在纖維重構中發揮著重要的作用。動物實驗證實：左心室壓力超負荷情況下TIMP-1mRNA的表達顯著增加［7］。亦有報道，在人心力衰竭時TIMP-1表達下調［8］，隨心衰加重，TIMP-1mRNA表達下調［6］。

在心肌受損時，在兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、腫瘤壞死因子α等神經內分泌細胞因子的作用下，MMPs表達上調，TIMPs下降，導致心肌間質纖維膠原合成和降解之間動態平衡的破壞，膠原降解加速，導致室腔擴大、室壁變薄、心室幾何形狀改變，導致心功能惡化及心肌纖維化。有報道：充血性心衰患者心功能分級，與MMP-3呈正相關，與TIMP1呈負相關，即心功能分級越高，MMP-3值越高，而TIMP-1值越低［9］。

中醫活血法能夠改善陽虛心衰大鼠的心功能及心室的重構，降低基質金屬蛋白酶-9基因及蛋白的表達，增加TIMP-1mRNA的表達［10］。丹參多酚酸鹽是從活血化瘀代表性中藥丹參中提取的，為水溶性酚類化合物，其具有抗氧自由基，降低血液黏度，抗血栓形成，改善血管內皮細胞功能，抑制超敏C反應蛋白、腫瘤壞死因子α及白介素6［11］，降低血漿BNP水平，改善心功能［12-13］的作用。此外其尚可降低基質金屬蛋白酶-9［14］，基質金屬蛋白酶-2［15］，起到抗纖維化的作用。

本實驗結果表明，高劑量丹參多酚酸鹽組及中西藥聯合組的大鼠心肌CVF和PVCA，與模型組相比均有所下降，聯合組上述結果最明顯，且優于單純卡托普利組。在心肌MMP-3方面，丹參多酚酸鹽高劑量組及中西藥聯合組都能夠降低其基因的轉錄及蛋白的表達，且中西藥聯合組與單純卡托普利組相比具有統計學差異。在TIMP-1方面，高劑量組的丹參多酚酸鹽較心衰模型組，無論基因還是蛋白表達方面均有所增高，但丹參多酚酸鹽和卡托普利聯用時效果最為明顯，且高于卡托普利組。

本研究通過建造大鼠心衰模型，觀察丹參多酚酸鹽對心衰大鼠心肌膠原重構的影響，證實丹參多酚酸鹽能減少心衰大鼠心肌間質膠原的沉積，能夠減少心肌MMP-3基因的轉錄及其蛋白的表達，同時增加TIMP-1基因的轉錄和蛋白的表達，使MMP-3/TIMP-1比值下降，減少膠原的降解，起到抗心肌纖維重構的作用。丹參多酚酸鹽的上述作用可能與其降低兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、TNF-α有關，但其具體機制有待進一步研究探討。此外，關于丹參多酚酸鹽與卡托普利聯合用藥對心肌纖維重構及MMP-3、TIMP-1的評價，究竟是何種劑量聯合方式效果最好，則有待進一步根據中效原理，或通過正交試驗設計來進行研究評定。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1099-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.040

2014-02-18

2011年福建省衛生廳青年科研課題 （2011-1-41）；2013年福建省中青年教師教育科研項目 （科技B類）（JB13105）

陳 成 （1981—），男，碩士，主治醫師，從事中西藥結合治療心血管病臨床研究。Tel：13850152745，E-mail：chencheng9936@163.com