基于NF-κB通路探討疏肝健脾含藥血清對LPS刺激下大鼠肝細胞、Kup ffer細胞炎癥損傷保護作用機制研究

韓 莉， 龔享文， 楊欽河*， 閆海震， 張玉佩， 李媛媛， 徐擁建， 張金文，林春梅

（1.暨南大學附屬第一醫院，廣東廣州510632；2.暨南大學醫學院，廣東廣州510632）

基于NF-κB通路探討疏肝健脾含藥血清對LPS刺激下大鼠肝細胞、Kup ffer細胞炎癥損傷保護作用機制研究

韓 莉1， 龔享文2， 楊欽河2*， 閆海震2， 張玉佩2， 李媛媛2， 徐擁建2， 張金文2，林春梅2

（1.暨南大學附屬第一醫院，廣東廣州510632；2.暨南大學醫學院，廣東廣州510632）

目的基于核轉錄因子kappaB（nuclear transcription factor-kappaB，NF-κB）信號通路探討脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激大鼠肝細胞及Kupffer細胞炎癥損傷以及疏肝健脾含藥血清的保護作用。方法通過體外培養以及免疫熒光鑒定SD大鼠肝細胞及Kupffer細胞，利用LPS刺激大鼠肝細胞及Kupffer細胞產生炎癥反應，酶聯免疫法檢測肝細胞及Kupffer細胞培養上清液中白介素-1（interleukin-1，IL-1）、人血清淀粉樣蛋白（seruMamyloid A，SSA）的表達，Western blot法檢測大鼠肝細胞及Kupffer細胞NF-κB通路相關蛋白的表達。結果每只大鼠通過純化后獲得肝細胞數量1.5×108～2.0×108個，Kupffer細胞數量0.5×107～1.0×107個，Typan blue染色測定肝細胞及Kupffer細胞活力均可達到95%以上。LPS組肝細胞及Kupffer細胞較空白血清組IL-1、SSA水平均有顯著升高 （P＜0.01）。而與LPS組比較，藥物干預組可顯著降低 （P＜0.01）。肝細胞、Kupffer細胞的蛋白表明，與空白血清組比較，LPS組肝細胞及Kupffer細胞NF-κB、IκB及磷酸化IKKβ蛋白表達均有顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，疏肝健脾方藥含藥血清能顯著下調肝細胞IκB及p-IKKβ蛋白的蛋白表達水平（P＜0.01），但NF-κB蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05），疏肝健脾含藥血清能下調Kupffer細胞NF-κB、IκB及p-IKKβ蛋白表達（P＜0.01）。結論疏肝健脾含藥血清能夠對LPS刺激大鼠肝細胞、Kupffer細胞炎癥損傷產生保護作用，其機制可能與NF-κB信號通路相關。

疏肝健脾方藥；NF-κB通路；肝細胞、Kupffer細胞；LPS刺激；炎癥損傷；含藥血清

疏肝健脾方藥由參苓白術散和柴胡疏肝散組成，其具有疏肝健脾，理氣祛濕的臨床療效，既往研究表明，疏肝健脾方能夠起到改善非酒精性脂肪性肝病患者臨床癥狀、調節肝功以及降低血脂的效果［1］。其可能與疏肝健脾方藥能夠通過肝細胞、Kupffer細胞NF-κB通路，使IL-1、TNF-α、IL-6等炎癥介質表達降低，從而減輕炎癥損傷相關［2-4］，但其具體途徑有待于進一步研究。本次研究基于體外培養大鼠肝細胞、Kupffer細胞，通過疏肝健脾含藥血清進行干預，從體外實驗角度探討疏肝健脾方藥作用途徑及機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選用SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體質量 （200±20）g之間，購自暨南大學動物實驗管理中心，許可證號SYXK（粵）2012-0117。各組大鼠依據隨機數字表法可分為正常組、細胞提取組，含藥血清提取組，每組各10只。

1.2 藥物及動物分組 疏肝健脾方藥是參苓白術散及柴胡疏肝散按1∶1比例的組合而成。參苓白術散：茯苓15 g、白術15 g、人參15 g、山藥15 g、白扁豆12 g、蓮子9 g、薏苡仁9 g、炙甘草9 g、砂仁6 g、桔梗6 g。柴胡疏肝散：柴胡6 g、陳皮6 g、枳殼5 g、香附5 g、白芍5 g、川芎5 g、炙甘草3 g。兩方均為中藥配方顆粒劑，由中國深圳華潤三九公司提供，各方藥物劑量和方劑組成參考國家《方劑學》教材［5］。疏肝健脾方藥組含藥血清的制備參考李儀奎等［6-7］的方法，其劑量為59.5 g/kg，該劑量是在體實驗劑量11.9 g/kg的5倍［8］，而正常組及細胞提取組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.3 試劑與儀器 胎牛血清（購自美國Hyclone公司）；Rabbit polyclonal to CK 18（Lot：20110823）、Goat anti-Rabbit IgG（H+L），FITC conjugated Rabbit polyclonal to ED1（Lot：100346）（購自中國鎮江厚普生物科技有限公司），IV型膠原酶 （購自美國Gbico公司）；LPS（Lot# 072M4100V）（購自美國Sigma公司）；IL-1試劑盒 （購自中國上海依科賽生物制品有限公司）、SSA試劑盒 （購自中國上海藍基生物科技有限公司）；NF-κB p65抗體、IKKβ抗體、p-IKKβ抗體（購自美國CST公司）；CO2細胞培養箱（購自美國Thermo Scientific公司）；ELISA檢測儀（購自美國Thermo Scientific公司）；冷凍離心機（購自德國Hamburg公司）；電泳儀、凝膠成像系統 （購自美國BIORAD公司）。

1.4 含藥血清制備 SD大鼠常規喂養1周。第8天起開始灌胃給予干預措施 （分別給予藥物和生理鹽水），連續給予3 d，每天2次，每12 h一次。干預結束后，通過腹主動脈采血，通過3 000 r/min離心后分離血清，而后熱滅活處理，0.22μm微孔濾膜進行過濾除去細菌，冰凍保存。

1.5 細胞提取及培養 大鼠肝細胞及Kupffer細胞分離與鑒定：采用離體循環灌注，差速離心法提取大鼠肝細胞及Kupffer細胞，具體方法參照本課題組前期方案［9］，分離獲得肝細胞及Kupffer細胞，將其接種在細胞培養瓶，并置于37℃的CO2培養箱中進行培養。

1.6 LPS刺激肝細胞及Kup ffer細胞及藥物干預 將大鼠肝細胞和Kupffer細胞分為6組，每組6孔，具體干預方案：空白血清組 （A組）：20%空白血清；LPS組 （B組）：20%空白血清+LPS（40 mg/L）；疏肝健脾組 （C組）：20%疏肝健脾含藥血清+LPS（40mg/L）。

1.7 指標檢測

1.7.1 顯微鏡觀察肝細胞及Kupffer細胞形態、狀態及免疫熒光鑒定 Typan blue染色后，應用倒置相差顯微鏡，在血細胞計數板上對所獲細胞進行常規計數，并鏡下觀察大鼠肝細胞及Kupffer細胞狀態，運用免疫熒光對大鼠肝細胞及Kupffer細胞進行細胞鑒定。

1.7.2 ELISA法檢測大鼠肝細胞及Kup ffer細胞上清IL-1、SSA 當每孔大鼠肝細胞及Kupffer數量分別不少于1×104個時，加入不含血清的DMEM/F12基礎培養基，之后再依據各組既定的干預方案添加藥物至所需的目標濃度后，再分別將大鼠肝細胞及Kupffer細胞放回細胞培養箱中繼續培養，24 h后分別吸取大鼠肝細胞及Kupffer細胞上清，保存備用。用ELISA法檢測大鼠肝細胞及Kup ffer細胞上清IL-1、SSA的表達水平。

1.7.3 Western blot法檢測大鼠肝細胞及Kupffer細胞NF-κB相關通路蛋白表達水平 取適量的細胞裂解液，在使用前3～5 Min內加入苯甲基磺酰氟，使得苯甲基磺酰氟最終濃度可以達到1 mmol/L。按照5×106～10×106個肝細胞或Kupffer細胞加入1 ML蛋白質裂解液，4℃，10 000～14 000×g，離心5～10 min，吸取上清，留下肝細胞或Kupffer細胞的沉淀備用。蛋白含量的測定選用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒，操作嚴格按照說明書。肝細胞及Kupffer細胞樣本通過凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗，孵育，4℃過夜，洗滌，二抗，再孵育及洗滌，化學發光，曝光，顯影，定影等步驟，再對結果進行光密度掃描分析。

1.8 統計學分析 用SPSSForWindows13.0軟件進行統計分析，用均數±標準差 （x±s）表示，各組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05有統計學差異。

2 結果

2.1 細胞數量 每只大鼠所獲肝細胞數量為1.5×108～2.0×108個，Kupffer細胞數量為0.5×107～1.0×107個。吸凈細胞培養基后，采用PBS進行細胞沖洗，再用胰蛋白酶進行消化，后行臺盼藍染色，測定肝細胞及Kupffer細胞的活力均可達95%以上。

2.2 細胞形態以及熒光鑒定 倒置相差顯微鏡下大鼠肝細胞呈圓形或橢圓形，邊界清晰，色澤光亮，體積增大，邊緣伸展（圖1-A）。Kupffer細胞呈圓點形狀，體積較肝細胞小，貼壁后Kupffer細胞呈梭形，部分有偽足 （圖1-B）。CK18對肝細胞進行免疫熒光鑒定，肝細胞釋放出綠色熒光，CK18陽性表達，提示為肝細胞 （圖1-D）。采用ED1對Kupffer細胞做免疫熒光鑒定，可見梭形的Kupffer細胞呈綠色熒光，ED1陽性表達，提示為Kup ffer細胞（圖1-D）。

圖1 細胞形態及免疫熒光鑒定

2.3 細胞狀態

2.3.1 肝細胞形態 空白血清組肝細胞生長狀態良好，色澤光亮，部分肝細胞體積明顯增大，呈現細胞分裂增殖，而LPS組可見部分肝細胞脫落，肝細胞漿里出現大小不一的空泡，細胞胞漿的顏色明顯變淡，部分肝細胞里的胞核消失，肝細胞形態明顯不規則，疏肝健脾組與空白血清組比較未見顯著差異 （見圖2）。

2.3.2 Kupffer細胞形態 空白血清組Kupffer細胞貼壁生長，少見細胞脫落，細胞多有偽足，呈健康的梭形細胞形態。LPS組可見大量細胞脫落或細胞攣縮成小圓點，貼壁細胞極少，細胞核不可見，偽足基本全部消失。疏肝健脾方組與空白血清組比較未見明顯差異 （見圖3）。

2.4 ELISA法檢測肝細胞及Kupffer細胞上清液中IL-1，SSA的表達水平 LPS組與空白血清組比較，肝細胞及Kupffer細胞IL-1、SSA的表達水平均有顯著升高（P＜0.01）。疏肝健脾組與LPS組比較，肝細胞及Kupffer細胞中IL-1、SSA的表達水平呈顯著降低 （P＜0.01），見圖4、5。

圖2 肝細胞形態

圖3 Kup ffer細胞形態

2.5 Western blot法檢測大鼠肝細胞NF-κB相關通路蛋白表達水平 LPS組與空白血清組比較，肝細胞NF-κB、IκB、IKKβ蛋白表達均有顯著升高 （P＜0.01）；疏肝健脾組與LPS組比較，疏肝健脾含藥血清不能下調肝細胞NF-κB蛋白下調（P＞0.05），能下調肝細胞IκB、IKKβ的蛋白表達水平，相互間比較有顯著差異 （P＜0.01），見圖6。

圖4 肝細胞及Kupffer細胞IL-1表達

圖5 肝細胞及Kupffer細胞SSA表達

圖6 肝細胞NF-κB信號通路相關蛋白灰度值及表達水平比較

2.6 Western blot法檢測大鼠Kupffer細胞NF-KB相關通路蛋白表達水平 LPS組與空白血清組比較：Kupffer細胞NF-κB、IκB、IKKβ蛋白表達均有顯著升高（P＜0.01）；疏肝健脾組與LPS組比較：疏肝健脾含藥血清能下調NF-κB、IκB、IKKβ蛋白下調（P＜0.01），見圖7。

圖7 Kup ffer細胞NF-κB信號通路相關蛋白灰度值及表達水平比較

3 討論

前期研究表明，長期高脂飼料喂養能夠誘導大鼠肝組織呈現典型NASH炎癥損傷病理改變，但具體機制有待于進一步研究。 “腸-肝”軸學說可能有助于該現象的闡釋，也給NASH的發病機制的深入研究提供了新的方向［10-11］。研究表明，高脂飲食可造成腸內養料來源的減少、改變腸道的細菌氧化還原狀態以及破壞菌群的微環境，從而影響腸道菌群的構成［12-14］。腸道微生態的破壞可以導致腸道內糞便中擬桿菌等有害菌增加，而雙歧桿菌等益生菌減少［15-16］。大量腸道寄存的陰性桿菌可以釋放大量內毒素（尤其是LPS），通過腸-肝血液循環進入肝臟，激活Kupffer細胞以及誘導細胞因子的產生和增加。同時腸道細菌性質和數量的變化也可導致腸道通透性增高以及腸道內毒素易位，誘導肝臟多種炎性細胞的轉錄基因及細胞因子的激活［17-18］。LPS來源于革蘭氏陰性菌外膜，是腸源性內毒素最重要的組成部分之一。本研究表明，LPS能夠刺激肝細胞和Kupffer細胞產生炎癥損傷，誘導炎癥因子IL-1，SSA表達明顯增加，并較LPS組有顯著性統計學差異。提示：LPS能夠對同時誘導肝細胞和Kupffer細胞兩種細胞產生炎癥損傷。這與Zenewicz，Zeng等的研究結果相一致［19-20］。

前期研究表明高脂飲食誘導NASH肝組織炎癥損傷與IKKβ/NF-κB信號通路活化密切相關，并且肝細胞、Kupffer細胞NF-κB、IκB蛋白及IKKβ磷酸化表達明顯增高［2-3，21］。本研究也表明在LPS的刺激下能夠激活IκB蛋白、NF-κB蛋白增加并使IKKβ磷酸化、并較對照組有顯著性統計學差異 （P＜0.01）。這與前期體內實驗結果相吻合。提示：LPS通過NF-κB信號通路在NASH發病中重要的作用。其具體作用機制可能與LPS刺激可以激活IKK復合物相關。IκB激酶（IKK）復合物是激活NF-κB信號通路主要調節器［22］。IκB激酶復合物包含兩個催化亞基：IKKα和IKKβ以及調節亞基IKKγ，其通過磷酸化IκB蛋白介導NF-κB活化響應于各種刺激。LPS刺激IκB蛋白磷酸化，泛素化，使NF-κB細胞核定位點暴露出來，進入細胞核后參與NF-κB依賴的基因的調節［23-24］。激活的NF-κB釋放大量炎癥介質又反饋加強IKKβ活化，形成IKKβ-NF-κB惡性循環而加重肝臟炎癥損害［25］。

既往研究表明：疏肝健脾方藥能夠通過肝細胞及Kupffer細胞NF-κB信號通路對高脂飲食誘導NASH炎癥損傷發揮保護作用，但其作用途徑有待于進一步研究［2-3］。中藥化學研究表明，疏肝健脾方藥含有橙皮苷、阿魏酸、柚皮苷等活性成分，而上述成分被證實具有的抗炎作用［26］。含藥血清用于體外細胞培養將為疏肝健脾方藥的作用途徑提供了新的研究方向。將藥物經口給藥后，取其含藥血清作為藥物源加入到離體的反應系統中從而研究其含藥血清的藥理作用，更加能夠反映藥物在體內環境中所產生藥理效應，其原有藥物成分或可在體內轉化成為藥物的活性成分，或這經代謝后失活，也可能經第二信使而發揮間接作用，所有這些均可通過血清藥理學研究所反映出來，從而使理論上更具科學性和真實性［27-28］。本次研究成功地從SD大鼠中提取并制備疏肝健脾含藥血清，并對LPS刺激大鼠體外肝細胞、Kup ffer細胞造成的炎癥損傷進行含藥血清干預，結果表明，疏肝健脾組大鼠肝細胞及Kupffer細胞狀態與正常血清組無顯著差異，并且疏肝健脾組IL-1、SSA炎癥介質釋放也較LPS組顯著減少，同時疏肝健脾含藥血清對肝細胞IκB蛋白、IKKβ磷酸化及Kupffer細胞NF-κB、IκB蛋白、IKKβ磷酸化蛋白的表達具有明顯的抑制作用。該結果提示：疏肝健脾含藥血清調控Kupffer細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達及活化，減少炎癥介質 （IL-1，SSA）的釋放，減輕炎癥反應。

［1］李玉權，楊欽河，謝維寧，等.疏肝健脾法治療非酒精性脂肪肝35例［J］.中醫雜志，2007，48（9）：824-825.

［2］楊欽河，徐擁建，馮高飛，等.疏肝健脾方藥對NASH大鼠原代肝細胞NF-κB信號通路相關基因及蛋白表達的影響［J］.中藥材，2013，36（9）：1469-1476.

［3］韓 莉，楊欽河，楊雪松，等.疏肝健脾方藥對NASH大鼠Kupffer細胞NF-κB p65和IKKβmRNA及蛋白表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29（4）：641-646.

［4］金 玲，楊欽河，張玉佩，等.疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織TNF-α、IL-6及IL-1的影響［J］.暨南大學學報：自然科學與醫學版，2012，33（2）：161-166.

［5］段富津.方劑學［M］.上海：上海科學技術出版社，1995：114-115，178-179.

［6］李儀奎.中藥血清藥理學實驗方法的若干問題［J］.中藥新藥與臨床藥理，1999，10（2）：31-34.

［7］李儀奎，吳健宇.中藥血清藥理實驗方法及其評價［C］//中華人民共和國國家中醫藥管理局、世界衛生組織.國際傳統醫藥大會論文摘要匯編.中華人民共和國國家中醫藥管理局、世界衛生組織，2000：1.

［8］魏 波，楊欽河，王文晶，等.疏肝健脾方對NASH大鼠肝組織IKKβmRNA和蛋白表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28（8）：1448-1454.

［9］馮高飛，楊欽河，王文晶，等.非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝細胞和庫普弗細胞同時分離及鑒定［J］.廣東醫學，2012，33（1）：40-43.

［10］Hojo M，Watanabe S.Pharmacological therapy of nonalcoholic steatohepatitis［J］.Hepatol Res，2011，41（3）：209-216.

［11］Compare D，Coccoli P，Rocco A，etal.Gut-liver axis：the impact of gutmicrobiota on non alcoholic fatty liver disease［J］. Nutr Metab Cardiovasc Dis，2012，22（6）：471-476.

［12］Ley R E，Turnbaugh P J，Klein S，et al.Microbial ecology：human gutmicrobes associated with obesity［J］.Nature，2006，444（7122）：1022-1023.

［13］Resta SC.Effects of probiotics and commensals on intestinalepithelial physiology：implications for nutrient handling［J］.J Physiol，2009，587（17）：4169-4174.

［14］Attene-Ramos MS，Nava G M，Muellner MG，et al.DNA damage and toxicogenomic analysesof hydrogen sulfide in human intestinal epithelial FHs 74 Int cells［J］.Environ Mol Mutagen，2010，51（4）：304-314.

［15］de La Serre C B，Ellis C L，Lee J，et al.Propensity to high-fat diet-induced obesity in rats is associated with changes in the gut microbiota and gut inflammation［J］.AMJ Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010，299（2）：G440-G448.

［16］Hekmatdoost A，FeizabadiMM，Djazayery A，etal.The effectof dietary oils on cecalmicroflora in experimental colitis in mice［J］.Indian JGastroenterol，2008，27（5）：186-189.

［17］Nagata K，Suzuki H，SakaguchiS.Common pathogenic mechanisMin developmentprogression of liver injury caused by non-alcoholic or alcoholic steatohepatitis［J］.JToxicol Sci，2007，32（5）：453-468.

［18］Vajro P，Paolella G，Poeta M，et al.Pediatric non alcoholic fatty liver disease：more on novel treatment targets［J］.BMC pediatrics，2013，13（1）：109.

［19］Zenewicz L A，Yancopoulos GD，Valenzuela DM，et al.Interleukin-22 but not interleukin-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation［J］.Immunity，2007，27（4）：647-659.

［20］ZengW，Zhang J，Li Y，etal.A new method to isolate and culture rat Kupffer cells［J］.PloS one，2013，8（8）：e70832.

［21］楊欽河，閆海震，張玉佩，等.疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織核因子-κBmRNA及蛋白表達的影響［J］.中國老年學雜志，2013，33（2）：324-328.

［22］Hinz M，ScheidereitC.The IκB kinase complex in NF-κB regulation and beyond［J］.EMBO reports，2014，15（1）：46-61.

［23］Oeckinghaus A，Hayden MS，Ghosh S.Crosstalk in NF-［kappa］B signaling pathways［J］.Nat Immun，2011，12（8）：695-708.

［24］Baker R G，Hayden MS，Ghosh S.NF-κB，inflammation，and metabolic disease［J］.Cell Metabol，2011，13（1）：11-22.

［25］Sunami Y，Leith?user F，Gul S，et al.Hepatic activation of IKK/NFκB signaling induces liver fibrosis viamacrophage-mediated chronic inflammation［J］.Hepatology，2012，56（3）：1117-1128.

［26］王術玲，賈 薇，高曉玲.柴胡疏肝散水提液HPLC特征圖譜研究及指標成分的測定［J］.中成藥，2012，34（12）：2384-2388.

［27］楊 萃.中藥復方在體外實驗的研究進展［J］.光明中醫，2013，28（10）：2229-2231.

［28］劉 紅.中藥復方藥理研究方法進展—血清藥理學［J］.湖北民族學院學報：醫學版，2004，21（4）：38-40.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1114-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.044

2014-02-12

國家自然科學基金項目 （30973694）；廣東省科技計劃資助項目 （2013B021800164）

韓 莉 （1963—），女，碩士，副主任醫師，從事中西醫結合肝病基礎與臨床研究。

*通信作者：楊欽河 （1961—），男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，從事中西醫結合肝病研究。E-mail：tyangqh@jnu.edu.cn