不同干燥方式對地龍提取物中17種氨基酸的影響

石召華， 黃文芳， 陳立軍， 劉享平

（1.湖北李時珍藥物研究院，湖北武漢430061；2.武漢愛民制藥有限公司，湖北鄂州436070；3.湖北省天然組分藥物工程技術研究中心，湖北鄂州436070）

不同干燥方式對地龍提取物中17種氨基酸的影響

石召華1，2， 黃文芳1，3， 陳立軍1，2， 劉享平2*

（1.湖北李時珍藥物研究院，湖北武漢430061；2.武漢愛民制藥有限公司，湖北鄂州436070；3.湖北省天然組分藥物工程技術研究中心，湖北鄂州436070）

目的研究不同干燥方式對地龍提取物中17種氨基酸的影響，確定其適宜的干燥方法。方法采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法，測定并比較真空冷凍干燥、真空減壓干燥和微波干燥3種方式所得地龍干燥樣品以及未經干燥樣品中的17種氨基酸的量。結果冷凍干燥所得產品中氨基酸的損失率小，含水量低，外觀色澤和形態均較優；谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸這6種氨基酸在真空減壓干燥下的損失率分別為5.01%、9.41%、7.45%、13.19%、4.99%和6.59%；除門冬氨酸和脯氨酸外，其他15種氨基酸在微波減壓下的損失率均在22.65%～55.97%之間。結論溫度是地龍氨基酸提取液干燥過程中的重要因素。真空冷凍干燥對地龍提取物中的17種氨基酸的影響較小，是地龍提取物較適宜的干燥方式。

地龍；氨基酸；柱前衍生；異硫氰酸苯酯；干燥方式；冷凍干燥

地龍，又稱蚯蚓，是常用中藥之一，其性味咸寒，有清熱熄風降壓平喘通絡利尿之功效［1］。研究發現地龍氨基酸含有量及組成與其藥理作用有很大關系［2-3］。廣地龍中含有丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸等多種氨基酸，成分復雜［4］，采用不同方法對地龍提取物進行干燥時，氨基酸的量可能差異較大。本研究采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法，對地龍提取液進行真空冷凍干燥、真空減壓干燥和微波干燥3種不同干燥方法所得地龍提取物中的17種氨基酸進行測定，結合含水量測定和產品外觀質量等，研究不同干燥工藝對地龍中氨基酸類化學成分的影響，優選地龍氨基酸提取物的干燥工藝。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料 地龍藥材購自亳州中藥材市場，產地廣東，批號20131106，經湖北省藥學會中藥鑒定分會陳科力教授鑒定為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體。

1.2 儀器 RE-5298旋轉蒸發器 （上海亞榮生化儀器廠）；LYO-0.5（CIP）真空冷凍干燥機 （上海東富龍科技股份有限公司）；DZG-6020型真空減壓干燥箱 （上海森信實驗儀器有限公司生產）；HWZ-5B箱式微波真空干燥機 （廣州興興微波能設備有限公司）；MA45紅外水分測定儀 （德國賽多利斯公司）；安捷倫1260液相色譜儀系統 （美國安捷倫公司）；電子分析天平 （梅特勒-托利多 （上海）儀器有限公司）。

1.3 試劑 三水合醋酸鈉 （分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；冰醋酸 （分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（HPLC級，美國TEDIA試劑）；正己烷（HPLC級，美國TEDIA試劑）；實驗用水為娃哈哈純凈水 （杭州娃哈哈集團）；17種混合氨基酸對照品溶液 （門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸）、衍生試劑A（異硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生試劑B（三乙胺-乙腈溶液）均來自月旭公司氨基酸分析包。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［5-6］Ultimate Amino Acid AAA氨基酸分析柱 （5μm，4.6 mm×250 mm，月旭材料科技有限公司）；體積流量1.0mL/min；柱溫40℃；進樣量5μL；檢測波長254 nm。流動相A為0.1 mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）-乙腈 （93∶7）；流動相B為水-乙腈，二元梯度洗脫，洗脫程序見表1。混合對照品及樣品的HPLC圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 樣品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取Welch公司17種氨基酸對照品溶液用水稀釋至原來濃度的1/10倍作為對照品。Welch公司17種氨基酸對照品溶液稀釋10倍后，門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的濃度均為0.25 mol/L，胱氨酸的濃度為0.125mol/L。

2.2.2 地龍藥材提取物的制備 稱取地龍粗粉10 g，加水100 mL，浸泡60 min，超聲處理 （250 W，50 Hz）60 min，12 000 r/min離心10min，取上清液，備用。

2.2.3 地龍氨基酸提取物的不同干燥樣品的制備 以含水量低于5%為干燥標準，精密量取地龍藥材提取物，分別采用不同方式干燥地龍氨基酸組分提取物。

2.2.3.1 真空冷凍干燥工藝 預凍溫度為-40℃，時間3 h；升華干燥溫度20℃，升溫時間2 h，時間為8 h；解析溫度為40℃，時間為8 h；工作壓力10～30 Pa。

圖1對照品與樣品HPLC圖

2.2.3.2 真空減壓干燥工藝 溫度控制在40℃左右，真空度控制在-0.09 MPa，提取液的相對密度控制在1.25左右，時間為4 h。

2.2.3.3 微波干燥工藝 將金屬溫度探頭置于樣品表面測量溫度，調節一定的微波功率進行輻射 （通過間隙輻射控制溫度在40℃以下）。

2.2.4 衍生步驟 分別將A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的1/5倍，精密量取 “2.2.1”項所制備對照品溶液1 mL，置于試管中，加入稀釋后的A溶液0.5 mL和稀釋后的B溶液0.5 mL，渦旋混合1 min，在50℃水浴中加熱45min，取出，加入正己烷溶液1 mL，振搖，渦旋混合1 min，靜置30 min，吸取下層澄清液體，用孔徑為0.45μm有機濾膜濾過，即得。供試品溶液稀釋到適宜濃度后的衍生步驟與對照品相同。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取Welch公司17種氨基酸對照品溶液用水稀釋至不同的濃度。分別取其1mL，按照“2.2.4”項下的衍生步驟和 “2.1”項下色譜條件進行操作，再注入液相色譜儀，進樣量5μL，記錄各氨基酸峰面積。分別以氨基酸對照品峰面積為縱坐標Y，以對照品進樣量 （ng）為橫坐標X，進行線性回歸，計算其回歸方程，見表2。17種氨基酸的相關系數在0.999 7～0.999 9之間，表明17種氨基酸的線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取 “2.2.4”項下的衍生化后供試品溶液，按照上述色譜條件連續進樣5次。17種氨基酸的峰面積RSD值在0.12%～3.4%之間，實驗結果表明儀器精密度良好。

表2 17種氨基酸線性關系及線性范圍

2.3.3 穩定性試驗 取 “2.2.4”項下的制備的同一份衍生化后供試品溶液，在上述色譜色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，進行測定。17種氨基酸的峰面積RSD值在0.17%～2.8%之間。表明供試樣品在24 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取 “2.2.4”項下的平行制備的5份衍生化后供試品溶液，按照上述色譜條件進行測定。17種氨基酸的峰面積RSD值在0.41%～3.6%之間，實驗結果表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取已知含有量的地龍氨基酸提取液5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入稀釋后的氨基酸混合對照品溶液5 mL，用純凈水稀釋到刻度。按照“2.2.4”項下衍生步驟及 “2.1”項下色譜條件進行測定并計算回收率。結果，17種氨基酸的的回收率均在94.6%～103.9%之間，RSD在1.2%～4.6%之間，表明此方法回收率良好。

2.4 干燥產品的外觀及含水量測定 分別采用真空減壓干燥、真空冷凍干燥和微波干燥3種方式對地龍氨基酸組分提取物進行干燥處理。各干燥產品用MA45紅外水分測定儀測定其含水量。結果 （見表3）表明，冷凍干燥所得產品含水量較低，外觀色澤以及形態較好，且樣品復溶性好。

表3 地龍提取物不同干燥方法所得產品外觀及含水量

2.5 樣品測定 分別精密量取地龍氨基酸提取液及其不同干燥樣品和混合對照品溶液，按照 “2.1.4”項下的衍生步驟和 “2.3”項下色譜條件進行操作，再注入液相色譜儀，進行測定，計算地龍氨基酸提取液及其不同干燥樣品種17種氨基酸的含有量 （外標一點法），17種氨基酸測定結果見表4。

表4 地龍提取物不同干燥產品中17種氨基酸的測定結果 （x±s）

3 討論

測定氨基酸的方法有柱前衍生化和柱后衍生化。柱后衍生化法是以茚三酮作為衍生化試劑的離子交換色譜法［7］，需專門的氨基酸分析儀。目前常用的柱前衍生化試劑有鄰苯二甲醛（OPA）、6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯（AQC）、2，4-二硝基氟苯 （DNFB）以及異硫氰酸苯酯（PITC）等。OPA不能和仲氨基酸反應［5-6］；AQC的衍生化水解產物會影響分離度［7-8］；DNFB試劑具有強致癌性，且需要在避光和一定的溫度條件下才能進行此反應，反應條件苛刻［9］；PITC衍生物單一、穩定，衍生副產物對HPLC測定無干擾，衍生化反應速度快，一、二級氨基酸均可被測定，目前應用較廣泛［10-12］，所以本實驗采用異硫氰酸苯酯作為柱前衍生化試劑來測定地龍提取液中的17種氨基酸。

本研究采用真空減壓干燥、真空冷凍干燥和微波干燥三種常用干燥方法對地龍提取物進行干燥處理，根據所得干燥產品中17種氨基酸的含有量以及含水量和外觀情況，優選地龍氨基酸提取物合適的干燥方式。結果表明冷凍干燥所得產品種氨基酸的損失率小，含水量低，外觀色澤和形態均較優。17種氨基酸中，對溫度較不敏感的氨基酸有門冬氨酸和脯氨酸，3種干燥方式對這兩種氨基酸含有量均沒有顯著性影響。而谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸對溫度比較敏感，45℃減壓干燥下這6種氨基酸的含有量損失率分別為5.01%、9.41%、7.45%、13.19%、4.99%、6.59%。而在微波干燥下，除門冬氨酸和脯氨酸這兩種比較穩定的氨基酸外，其他15種氨基酸的含有量損失率均在22.65%～55.97%之間。綜上，氨基酸類成分對熱較敏感，溫度是地龍氨基酸提取物干燥過程中的重要因素。真空冷凍干燥是地龍氨基酸提取物較適宜的干燥方式。

［1］張曉晨.地龍藥理與臨床研究進展［J］.中成藥，2011， 33（9）：1574-1578.

［2］劉亞明，郭繼龍，劉必旺，等.中藥地龍的活性成分及藥理作用研究進展［J］.山西中醫，2011，27（3）：44-45.

［3］何 琳，龍曉英，謝禮新，等.地龍配方顆粒的質量標準研究［J］.中成藥，2007，29（8）：1173-1177.

［4］裴福成，李長新，任桂萍.柱前衍生HPLC法測定地龍中氨基酸的含量［J］.中醫藥學報，2007，35（3）：26-27.

［5］蔡 萍，萬 丹，肖 娟，等.土鱉蟲超微粉體中游離氨基酸的測定及指紋圖譜研究［J］.中成藥，2011，33（10）：1645-1648.

［6］黃哲甦，隋玉榮，李海生，等.異硫氰酸苯酯柱前衍生法測定安尿通中3種氨基酸含量［J］.現代儀器，2005，11（2）：14-15.

［7］Checa-Moreno R，Manzano E，Mirón G，et al.Revisitation of the phenylisothiocyanate-derivatives procedure for amino acid determination by HPLC-UV［J］.J Sep Sci，2008，31（22）：3817-3828.

［8］黃璐敏，詹云麗，黃丹瑩，等.2種柱前衍生法測定地龍注射液主要氨基酸的含量［J］.中國醫藥指南，2012，10（20）：90-92.

［9］呂瑩果，張 暉，孟祥勇，等.氨基酸分析測定及衍生化方法［J］.糧食與油脂，2009，（07）：35-38.

［10］高曉燕，蘇建坤，王 雪，等.異硫氰酸苯酯法測定清開靈注射液中氨基酸的含量［J］.北京中醫藥大學學報，2012，35（8）：554-558.

［11］楊 智，陽利龍，祝文兵，等.異硫氰酸苯酯柱前衍生化RP-HPLC法測定人血漿中10種氨基酸的濃度［J］.中國臨床藥理學與治療學，2011，16（5）：549-552.

［12］楊 菁，孫黎光，白秀珍，等.異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法同時測定18種氨基酸［J］.色譜，2002，20（4）：369-371.

R284.1

：B

：1001-1528（2015）05-1135-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.049

2014-07-18

國家十二五重大新藥創制科技重大專項經費資助項目 （2014ZX09201-022-03）；湖北省重大科技創新專項經費資助項目（2013ACC005）

石召華 （1975—），男，博士，高級工程師，從事中藥制劑研究。Tel：（0711）3818216，E-mail：whimyf@163.com

*通信作者：劉享平 （1964—），男，博士，高級工程師，從事中藥現代化研究。Tel：（0711）3818208，E-mail：lxp821@sina.com