丹參聯合參附注射液對大鼠重癥胰腺炎腎臟NF-κB 調控的研究

楊勝波， 丁憲群， 牛 剛， 張 建， 楊媛媛

(1. 貴陽中醫學院第二臨床醫學院，貴州 貴陽550001;2. 貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州 貴陽550001)

重癥急性胰腺炎(severe acute panereatitis，SAP)是胰腺組織自身消化為基礎與胰腺自身的壞死為主要特征的全身性疾病，可以引起局部和全身性的過度炎癥反應，造成血管滲出、低血容量、休克及多臟器功能障礙等系統性炎癥反應綜合征(SIRS)，甚至可以導致多器官功能衰竭(MODS)。其中，腎功能障礙的發生率僅次于肺功能障礙，大約占50%［1］，當疾病發展到腎功能衰竭后，導致與其相關臟器衰竭的發生率也明顯上升。目前，胰腺炎發病機制并不完全明確，研究其發生與發展有關的通路及信號分子已經成為熱點。其中，核轉錄因子-κB (NF-κB)就已經成為研究的焦點。目前，NF-κB 已被證實在SAP 中表達量增加，由此可推斷該因子在SAP 發生、發展中扮演著重要的角色［2］。丹參和參附注射液具有抑制炎癥并改善微循環等功能，基于此，本實驗采用丹參聯合參附注射液干預SAP大鼠腎損害模型，觀察其腎組織NF-κB 及血清Cr、BUN 的變化，旨在探討丹參和參附注射液可能的作用機制，為該藥在臨床上的運用提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級成年健康SD 大鼠72 只(第三軍醫大學實驗動物中心，合格證號SCXK (渝)2014-005)。參附注射液(雅安三九藥業有限公司，批號131023010);丹參注射液(正大青春寶公司，批號1405133);牛黃膽酸鈉(Sigma 公司);NF-κB/P65 (L523)亞單位一抗(Bioworld Technology 公司)。全自動生化分析儀(貴陽中醫學院第二附屬醫院檢驗科)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SAP 大鼠模型的建立［3］72 只SD 大鼠術前12 h 禁食，但予以自由飲水。水合氯醛麻醉后，脫毛膏腹部脫毛、固定、消毒，正中切口入腹，從肝十二指腸韌帶肝門側用小動脈夾暫時夾閉膽胰管，4 號針頭由十二指腸前壁處進針，經乳頭部插入膽胰管內，以0.2 mL/min 的速度向膽胰管內推注5%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g)，見胰膽管擴張后將針頭拔出，并加壓阻塞膽胰管進入十二指腸的開口，2 min 后解除加壓，可見胰腺組織迅速出現水腫、充血、沿血管壁兩側出現發紅、片狀紫紅、或點狀，取下小動脈夾并予以關腹。術后可自由飲水、禁食。

1.2.2 藥物干預SAP 大鼠模型 丹參聯合參附注射液治療組建模后立即由尾靜脈緩慢注射，丹參和參附注射液各0.2 mL/100 g［4］，假手術組、SAP 模型組予以注射等體積的生理鹽水。

1.2.3 標本采集 藥物干預6、12、24 h 后予以麻醉，由原切口開腹，腹腔靜脈采取血液送檢;取胰腺及左腎標本，觀察組織大體顏色、形態，并將其分別放于10%甲醛液中待作蘇木素-伊紅染色鏡檢，取右腎于80 ℃冰箱保存，待行免疫組織化學法檢測NF-κB 的表達。

1.2.4 統計學處理 各組實驗均采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料采用±s 表示，組間資料比較采用ANOVA和t 檢驗，P ＜0.05 具有統計學意義。

2 結果

2.1 SAP 模型大鼠腎臟組織NF-κB 蛋白的表達 模型建立成功后，SAP 模型組腎臟NF-κB 的表達隨著時間的推移逐漸升高，在24 h 達到高峰，而SAP 丹參聯合參附治療組與其比較則有明顯的下降(P ＜0.01);假手術組NF-κB 的表達隨著時間的推移無明顯的變化(P ＞0.05);SAP 模型組與其他兩組相比較，NF-κB 的表達明顯增高(P ＜0.01)。提示丹參聯合參附注射液能夠抑制使SAP 模型大鼠腎損害腎臟NF-κB 的表達，見表1。

表1 SAP 模型大鼠腎臟組織NF-κB 蛋白的表達積分光密度(IOD)的變化(±s，n=8)

表1 SAP 模型大鼠腎臟組織NF-κB 蛋白的表達積分光密度(IOD)的變化(±s，n=8)

注:SAP 模型組與假手術組比較，* P ＜0.01;SAP 模型組與丹參聯合參附注射液治療組比較，Δ P ＜0.01;同組各時相比較，ψ P ＜0.01，下表同

組別 NF-κB 積分光密度(IOD)6 h 12 h 24 h假手術組7.46 ±0.550 7.26 ±0.833 7.33 ±0.815 SAP 模型組 31.58 ±3.805* 45.30 ±3.537* ψ 56.79 ±3.500* ψ丹參聯合參附注射液治療組 19.76 ±2.206Δ 30.41 ±3.314Δψ 40.89 ±3.435 Δψ

2.2 SAP 模型大鼠血清BUN、Gr 的變化 模型建立成功后，SAP 模型組血清Gr、BUN 隨著時間的推移逐漸升高，在24 h 達到高峰，而SAP 丹參聯合參附治療組與其比較則有明顯的下降(P ＜0.01);假手術組血清Gr、BUN 隨著時間的推移無明顯的變化(P ＞0.05);SAP 模型組與其他兩組相比較，血清Gr、BUN 明顯增高(P ＜0.01)。提示丹參聯合參附注射液能夠使SAP 模型大鼠腎損害血清Gr、BUN明顯下降，見表2。

表2 SAP 模型大鼠藥物干預后不同時間血清Gr、BUN 的變化(±s，n=8)

表2 SAP 模型大鼠藥物干預后不同時間血清Gr、BUN 的變化(±s，n=8)

組別 血清Gr/(mmol·L -1)血清BUN/(μmol·L -1)6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h假手術組 45.3 ±3.73 45.1 ±4.55Φ 45.6 ±3.62Φ 5.6 ±0.93 6.09 ±1.12Φ 5.8 ±1.10 Φ SAP 模型組 70.4 ±5.83* 90.9 ±5.72* ψ 127.1 ±5.99* ψ 9.9 ±0.91* 16.4 ±1.03* ψ 21.8 ±1.77#ψ丹參聯合參附注射液治療組 61.2 ±4.65#Δ 78.4 ±5.21#Δ Ω 94.1 ±5.00#Δ Ω 7.6 ±1.06#Δ 11.1 ±0.86#Δ Ω 17.2 ±1.10#Δ Ω

2.3 胰腺組織、腎組織蘇木素-伊紅染色 胰腺組織、腎組織通過蘇木素-伊紅染色后假手術組胰腺組織HE 染色顯示，組織結構正常，腎臟無水腫、出血及壞死;SAP 丹參聯合參附治療組胰腺間質局部出血，腎臟腎組織間質出血，部分腎小球結構破壞;SAP 模型組胰腺腺泡結構破壞，有大片壞死灶，間質水腫，胰腺間質大量中性粒細胞浸潤，腎臟腎小球結構破壞、間質水腫，中性粒細胞浸潤，見圖1、圖2。

圖1 胰腺組織蘇木素-伊紅染色(×200)

圖2 腎臟組織蘇木素-伊紅染色(×200)

3 討論

重癥急性胰腺炎是臨床比較多見的且較為兇險的疾病，病死率可以達到30% ～40%［5］，急性腎功能損害是SAP 嚴重的的并發癥之一。國外相關報道提示SAP 合急性腎功能損害的死亡率高達63%，而國內相關報道則為50%左右［6-7］。

SAP 發病機制目前認為是膽石的阻塞為主要誘因之一，膽石阻塞后導致胰液流出道嚴重受阻，膽汁逆流進入胰管，胰管內壓力不斷上升，進而造成腺泡及胰管的破壞而導致SAP 發生。SAP 發生后胰腺可以釋放較多的血管活性多肽具有較強的腎毒性作用。隨著胰蛋白酶的明顯增加，可明顯激活腎素-血管緊張素系統，從而啟動腎小球的血管收縮，導致腎小球動脈壓下降［8］，蛋白溶解酶可進一步導致腎小球的通透性增加，繼發腎小管和腎間質的損害，最終導致急性腎功能衰竭的發生。

核轉錄因子κB (NF-κB)是一種廣泛存在于人體組織和細胞中的核轉錄因子，主要參與調節機體炎癥、胚胎發育、組織損傷和修復等相關的基因表達［9-10］。相關研究顯示，多種炎性因子如IL-1、TNF-ɑ、IE 等啟動子或者增強子基因中存在κB 的相關序列，而NF-κB 可誘導相關炎性介質的產生，從而激活相關基因及早期炎癥反應基因，產生較多的炎癥因子［11］。Gukovsky 等［12］在SAP 動物模型中發現建模30 min 后即有NF-κB 較高的表達，并指出NF-κB 的高表達在急性胰腺炎的炎性反應中至關重要，可以引起SAP胰腺組織中炎性介質的釋放增加。SAP 的發生、發展，NFκB 的活化成為其發病的使動作用。另外，炎性因子的大量釋放，又可以調劑NF-κB 的進一步活化，從而導致SAP 發生、發展進入惡性循環。由此可見，NF-κB 的活化在SAP疾病發生、發展過程中誘導大量的炎性因子參與，從而導致胰腺出現嚴重的病理生理的改變，進而出現一系列的臨床表現。

中醫認為丹參具有活血通絡、涼血消癰、祛瘀止痛等功效，近年來，大量的臨床研究表明，丹參具有擴張微血管和改善微循環等臨床作用，朱穎煒等［13］臨床觀察結合應用丹參注射液治療可以減少SAP 并發癥的發生率，且能降低死亡率和縮短療程，提高治愈率;劉明東等［3］認為丹參能抑制內毒素引起的促炎遞質如一氧化氮(NO)、TNF-α，IL-1β 等的產生。而參附注射液具有回陽救逆，益氣固脫的功效，主要用于陽氣暴脫的厥脫癥，中醫認為氣能攝血，氣能行血，初云海等［14］研究表明參附注射液能改善腎血流灌注機制保護腎損傷，并且具有通過抑制脂質過氧化反應，從而達到減輕自由基損傷。故本實驗選用丹參聯合參附注射液作為實驗用藥。

本實驗采用膽胰管逆行注射牛磺膽酸鈉誘導大鼠SAP模型。建模成功后可觀察到胰腺組織充血水腫，甚至出現點狀、片狀的出血灶，同時可觀察腎臟充血水腫等;而光鏡下可見胰腺腺泡被破壞，間質出現水腫，甚至出血，且有大量粒細胞聚集浸潤;同時腎間質出現水腫出血，粒細胞浸潤，部分腎小球破壞。模型組與假手術組比，NF-κB的表達增加，血清肌酐、尿素氮均升高;SAP 丹參聯合參附治療組與SAP 模型組相比，NF-κB 蛋白的表達以及血清Cr、BUN 減少，而光鏡下可見丹參聯合參附治療組胰腺、腎臟組織炎癥較SAP 模型組明顯減輕。說明丹參聯合參附注射液能夠抑制SAP 大鼠腎臟組織的NF-κB 的表達，抑制炎癥反應的發生，有效控制血清Cr、BUN 的水平，從而達到治療SAP 及保護腎功能的作用。

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