不同長春花中3種生物堿的含量測定

詹小寧

【摘 要】 目的：建立快速準確的長春花內生物堿含量測定方法，為尋找高含量品種提供方法和依據。方法：采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），對收集到的10個長春花品種中的文多靈、長春質堿、長春堿含量進行了測定，色譜柱：Dikma Diamonsil-C18 （ 46mm ×250mm， 5μm）；流動相為A∶07%二乙胺（磷酸調整pH至72）；B：乙腈：甲醇=25：40。A∶B=35∶65；流速1ml/min。柱溫35℃。檢測波長：280nm。結果：文多靈：Y=200×106X+546×104，r=09999，線性范圍：02～4μg；長春質堿：Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍：02～4μg；長春堿：Y=176×106X-717×104，r=09999，線性范圍：02～4μg。文多靈含量最高的是1號品種，長春質堿含量最高的是3號品種，長春堿含量最高的是2號品種，三種生物堿總和最高的是3號品種。結論：該方法簡便、快速，分析準確，適合對長春花內主要生物堿做高通量的篩選。綜合考慮總堿的含量和最重要的長春堿的含量，1號品種適合作為代謝調控的本體。[JP]

【關鍵詞】 長春花；長春堿；長春質堿；文多靈；RP-HPLC

【中圖分類號】R2841 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）24-0010-04

Determination of three kinds of important alkaloids in Catharanthus roseus from ten different habitats

ZHAN Xiao-ning

The first affiliated hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China

Abstract：Objective To establish a fast and accurate method of determination of alkaloids in Catharanthus roseus for finding high-content varieties. Method To determinate the contents of Vinblastine， Catharanthine and Vindoline in the 10 varieties of Catharanthus roseus by RP-HPLC，HPLC method is performed on Dikma Diamonsil - C18 （46mm×250mm， 5μm）column， mobile phase：A：07% diethylamine（pH 72 adjusted by phosphoric acid ）；B：acetonitrile∶methanol =25∶40.A∶B = 35∶65； flow rate is 1ml/min.Column temperature is 35 ℃. Detected at 280nm.Results Vindoline：Y=200×106X+546×104，r=09999，linear range：02 ～ 4μg；Catharanthine：Y=228×106X+831×104，r=09999，linear：02 ～ 4μg；Vinblastine：Y=176×106X-717×104，r=09999，linear range：02～ 4μg.The species of the highest content of vindoline is the 1st， Catharanthine is the 3rd， vinblastine is the 2nd species， the highest sum of three alkaloids is on the 3rd varieties.Conclusion This method is simple， reliable， repeatable， and is suitable for High-throughput screening of the Alkaloids content in Catharanthus roseus. The 1st varieties is suitable as the body of metabolic regulation.

Keywords：Catharanthus roseus； vinblastine； catharanthine； vindoline； RP-HPLC

長春花Catharanthus roseus （L. ） G. Don 為夾竹桃科（Apocynaceae） 長春花屬（Catharanthus） 植物，原產于非洲東海岸，現廣泛分布于世界各地，我國的廣東、廣西、云南、海南、貴州、四川以及江浙一帶均有栽培。作為一種傳統的民間藥用植物，長春花常被用來治療瘧疾、腹瀉、糖尿病、高血壓、皮膚病及何杰金氏病等。長春花的主要活性成分生物堿（Alkaloids）是植物天然次生代謝產物中數量最多的一類含氮堿性化合物。許多生物堿由于具有特殊的藥理學活性已引起人們越來越多的關注。長春花中含有的長春堿（Vinblastine）是一類重要的抗腫瘤萜類吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids， TIAs） [1]，在臨床上主要用于治療何杰金氏病和絨毛上皮癌，對淋巴肉瘤、黑色素瘤、卵巢癌、白血病等也有一定療效，是目前廣泛應用的抗腫瘤植物藥之一[2]。此外，文多靈和長春質堿還是合成長春堿的前體[3]。目前，長春堿、長春新堿和長春瑞賓已經用于臨床[4]。長春花類生物堿的主要來源依然是從天然植物中提取，但這些生物堿在天然長春花植株中含量較低，隨著市場需求的增加，從天然長春花植株中提取生物堿不能滿足市場需求。利用細胞培養等方法生產長春花生物堿的研究雖然取得了一些進展，但是大規模培養的細胞生物堿產量很低[5]，而且由于培養細胞中不表達一些合成途徑的關鍵基因，使得部分生物堿無法在培養細胞中合成[6]，因此還不具備投入生產的潛力。近年來，旨在提高長春花植株中生物堿含量的研究開展很廣泛，特別是利用代謝調控的方法獲得生物堿含量高的長春花品種獲得了較大進展[7]，因此我們需要尋找現有品種中生物堿含量高的品種，以其為研究對象，利用代謝調控方法獲得高含量的長春花品種，解決現有的資源不足的問題。

本研究利用RP-HPLC[8]方法對收集到的10種長春花品種中的文多靈、長春質堿和長春堿的含量進行分析，以期獲得長春花類生物堿含量高的品種。

1 儀器與試劑

11 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色譜工作站（美國Waters公司）；DL-720B型超聲水?。ㄉ虾Ｖ艃x器有限公司）；DHG-9075A型恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型電子天平（德國賽多利斯儀器公司）； PHS-3TC型pH計（上海天達儀器有限公司）；Ultrapure uvf純水儀（上海和泰儀器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋轉蒸發儀（上海魯伊工貿有限公司）。

12 試劑 文多靈批號2182-14-1，2100-2011；長春質堿批號2468-21-5，10605-2011；長春堿批號143-67-9，9011-2010，購自上海同田生物技術股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純， 二乙胺、磷酸為分析純，水為高純水。

13 材料 本實驗選用長春花購于美國泛美種子公司，包括太平洋系列品種5種，清涼系列品種2種，大力神系列品種3種。10種長春花藥材均種植于上海交通大學農業與生物學院農場。采用溫室大棚種植，溫度保持在20℃以上。于8月采集樣品，每個品種隨機選取3株，收集植株的葉子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；準確稱量干粉各05g，將同一品種的3份干粉混合均勻后保存于4℃冰箱備用。

2 實驗方法

21 標準品的配制 精密稱取三種標準樣品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超聲20min使之溶解后，定容至刻度，濃度為1mg/ml。經04μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。使用時根據需要用色譜純甲醇稀釋。

22 測試樣品的制備方法的選擇

221 提取溶劑的選擇 準確稱取同一樣品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分別精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超聲（功率600W，頻率99 kHz）提取30min，放冷，分別補加相應溶劑至刻度，搖勻，045μm微孔濾膜過濾，取續濾液10μl，注入液相色譜儀，測定。結果表明以甲醇作溶劑，文多靈、長春質堿、長春堿的提取率均高于其他溶劑，故本法采用甲醇作為提取溶劑。

222 提取方法的選擇 冷浸法：樣品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，離心后傾出上清液，重復3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；超聲法：1g樣品，加甲醇10ml，超聲半小時，離心后傾出上清液，重復3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；熱回流法：樣品1g，加10ml甲醇，60℃熱回流提取3次，合并提取液減壓蒸干，5ml甲醇定容。將3種方法提取液分別過045μm微孔濾膜，進樣10μl，測得熱回流和超聲法提取效率均高于冷浸法，考慮到試驗的可操作性和安全性，故選擇超聲法提取。

通過進一步的優化發現用5倍量的甲醇超聲2次，即能提取完全，超聲前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最終選定測試樣品制備方法為：精密稱取樣品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超聲30min，12000rpm離心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，離心，合并兩次的上清液，減壓干燥至恒重，1ml甲醇定容；經045μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

23 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色譜柱。流動相為A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸調整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱溫35℃；檢測波長：280nm；進樣量為40μl。文多靈、長春質堿、長春堿與相鄰色譜峰分離度均大于15，理論塔板數按三者的峰計算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范圍內。文多靈、長春質堿和長春堿的保留時間分別為9909、13819、17206min。

24 精密度試驗 取21項下標準品混合溶液，自動進樣器進樣40μl，重復6次，測得三種生物堿峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

25 穩定性實驗 精密吸取供試品液40μl，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定三種生物堿的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為140%、094%、161%，表明供試品液在24h內穩定。

26 重復性實驗 準確稱取同一樣品6份，每份02g，按照23項下色譜條件進行測定，三種生物堿的含量的相對標準偏差（RSD）分別為198%、145%、138%，表明方法重復性良好。

27 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（樣品1）3份，每份02g，分別加入上述混合標準品02，04，08ml，形成高、中、低3個濃度，依照上述方法進行樣品處理和測定，計算三種生物堿的回收率，結果平均回收率分別為10284%、9886%、9773%，RSD分別為135%、209%、245%，表明方法加樣回收率良好。

28 色譜峰純度分析 采用Empower 軟件系統對樣品中的文多靈，長春質堿和長春堿分析峰純度，峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖1） ，色譜峰純度角值小于閾值，表明吸收峰為光譜純。通過分別和文多靈，長春質堿，長春堿的標準品的光譜曲線匹配，亦匹配良好。

29 標準曲線 將上述標準品溶液稀釋至01μg/μl，用自動進樣器分別進樣5級標準：分別精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，上述色譜條件洗脫，測定峰面積。通過Empower軟件制作以文多靈，長春質堿，長春堿進樣量X（單位：μg）為橫坐標，峰面積Y（單位：微伏*秒） 為縱坐標繪制標準曲線。 文多靈回歸方程為Y=200×106X+546×104， r=09999，線性范圍為02～40μg。長春質堿回歸方程為Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍為02～40μg。長春堿回歸方程為Y=176×106X-717×104 ，r=09999，線性范圍為02～40μg。

3 實驗結果

按上述方法對10份長春花樣品進行測定。每批重復測定3次，結果見表1。

4 討論

在長春花樣品制備的方法中，常見的有甲醇提取法和酸液提取-堿化后有機溶劑萃取法[9]。通過比較發現，甲醇提取效率高，速度快，雖然提取物中含有較多雜質，然而通過改變洗脫條件，可以讓目的成分和雜質有效分離，并不影響測定。酸液提取-堿化后有機溶劑萃取法的提取物中雖然雜質較少，但是操作復雜，步驟繁多。本研究旨在多品種間的橫向比較，故盡量采用簡便的操作辦法，回避操作誤差，因此本研究采用甲醇提取法。通過優化，采用1ml甲醇提取02g葉片干粉2次，操作可以縮小到2ml離心管內進行，便于大量操作。提取物濃度合適，通過適當增加進樣量，能夠保證含量較少的長春堿可以被檢測到。

在色譜條件的選擇中，流動相中甲醇和乙腈的比例對分離度和峰形均有較大影響，乙腈的增加有助于獲得良好的峰形，但當乙腈比例大于25%時，長春質堿會和樣品中的長春堿形成交叉，加入甲醇有助于兩者的分離。同時，在流動相中選擇二乙胺-磷酸溶液為緩沖體系，并通過調節溶液A與溶液B的比例使3種物質得到較好的分離。在實驗中，當A 的比例大于35%時，最后出峰的長春堿保留時間延長，當A的比例小于35%時，長春堿保留時間前移和樣品中極性大的雜質混出，難以得到滿意的分離度。因此，A∶B的比例在35∶65 時較為適宜。流動相的pH值對分離效果也有很大的影響，實驗以緩沖溶液調整流動相的pH值。將緩沖溶液的pH值分別設為50、60、70、72、74、76、和78，觀察pH值對峰形及分離效果的影響。結果表明：當緩沖溶液pH值為72時，各峰間分離度增大，峰形較好，出峰時間適宜。因此，選擇緩沖溶液pH值為72。

本研究利用RP-HPLC[8]方法對收集到的10種長春花品種中的文多靈、長春質堿和長春堿的含量進行分析，以期獲得長春花類生物堿含量高的品種。

1 儀器與試劑

11 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色譜工作站（美國Waters公司）；DL-720B型超聲水?。ㄉ虾Ｖ艃x器有限公司）；DHG-9075A型恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型電子天平（德國賽多利斯儀器公司）； PHS-3TC型pH計（上海天達儀器有限公司）；Ultrapure uvf純水儀（上海和泰儀器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋轉蒸發儀（上海魯伊工貿有限公司）。

12 試劑 文多靈批號2182-14-1，2100-2011；長春質堿批號2468-21-5，10605-2011；長春堿批號143-67-9，9011-2010，購自上海同田生物技術股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純， 二乙胺、磷酸為分析純，水為高純水。

13 材料 本實驗選用長春花購于美國泛美種子公司，包括太平洋系列品種5種，清涼系列品種2種，大力神系列品種3種。10種長春花藥材均種植于上海交通大學農業與生物學院農場。采用溫室大棚種植，溫度保持在20℃以上。于8月采集樣品，每個品種隨機選取3株，收集植株的葉子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；準確稱量干粉各05g，將同一品種的3份干粉混合均勻后保存于4℃冰箱備用。

2 實驗方法

21 標準品的配制 精密稱取三種標準樣品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超聲20min使之溶解后，定容至刻度，濃度為1mg/ml。經04μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。使用時根據需要用色譜純甲醇稀釋。

22 測試樣品的制備方法的選擇

221 提取溶劑的選擇 準確稱取同一樣品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分別精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超聲（功率600W，頻率99 kHz）提取30min，放冷，分別補加相應溶劑至刻度，搖勻，045μm微孔濾膜過濾，取續濾液10μl，注入液相色譜儀，測定。結果表明以甲醇作溶劑，文多靈、長春質堿、長春堿的提取率均高于其他溶劑，故本法采用甲醇作為提取溶劑。

222 提取方法的選擇 冷浸法：樣品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，離心后傾出上清液，重復3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；超聲法：1g樣品，加甲醇10ml，超聲半小時，離心后傾出上清液，重復3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；熱回流法：樣品1g，加10ml甲醇，60℃熱回流提取3次，合并提取液減壓蒸干，5ml甲醇定容。將3種方法提取液分別過045μm微孔濾膜，進樣10μl，測得熱回流和超聲法提取效率均高于冷浸法，考慮到試驗的可操作性和安全性，故選擇超聲法提取。

通過進一步的優化發現用5倍量的甲醇超聲2次，即能提取完全，超聲前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最終選定測試樣品制備方法為：精密稱取樣品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超聲30min，12000rpm離心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，離心，合并兩次的上清液，減壓干燥至恒重，1ml甲醇定容；經045μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

23 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色譜柱。流動相為A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸調整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱溫35℃；檢測波長：280nm；進樣量為40μl。文多靈、長春質堿、長春堿與相鄰色譜峰分離度均大于15，理論塔板數按三者的峰計算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范圍內。文多靈、長春質堿和長春堿的保留時間分別為9909、13819、17206min。

24 精密度試驗 取21項下標準品混合溶液，自動進樣器進樣40μl，重復6次，測得三種生物堿峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

25 穩定性實驗 精密吸取供試品液40μl，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定三種生物堿的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為140%、094%、161%，表明供試品液在24h內穩定。

26 重復性實驗 準確稱取同一樣品6份，每份02g，按照23項下色譜條件進行測定，三種生物堿的含量的相對標準偏差（RSD）分別為198%、145%、138%，表明方法重復性良好。

27 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（樣品1）3份，每份02g，分別加入上述混合標準品02，04，08ml，形成高、中、低3個濃度，依照上述方法進行樣品處理和測定，計算三種生物堿的回收率，結果平均回收率分別為10284%、9886%、9773%，RSD分別為135%、209%、245%，表明方法加樣回收率良好。

28 色譜峰純度分析 采用Empower 軟件系統對樣品中的文多靈，長春質堿和長春堿分析峰純度，峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖1） ，色譜峰純度角值小于閾值，表明吸收峰為光譜純。通過分別和文多靈，長春質堿，長春堿的標準品的光譜曲線匹配，亦匹配良好。

29 標準曲線 將上述標準品溶液稀釋至01μg/μl，用自動進樣器分別進樣5級標準：分別精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，上述色譜條件洗脫，測定峰面積。通過Empower軟件制作以文多靈，長春質堿，長春堿進樣量X（單位：μg）為橫坐標，峰面積Y（單位：微伏*秒） 為縱坐標繪制標準曲線。 文多靈回歸方程為Y=200×106X+546×104， r=09999，線性范圍為02～40μg。長春質堿回歸方程為Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍為02～40μg。長春堿回歸方程為Y=176×106X-717×104 ，r=09999，線性范圍為02～40μg。

3 實驗結果

按上述方法對10份長春花樣品進行測定。每批重復測定3次，結果見表1。

4 討論

在長春花樣品制備的方法中，常見的有甲醇提取法和酸液提取-堿化后有機溶劑萃取法[9]。通過比較發現，甲醇提取效率高，速度快，雖然提取物中含有較多雜質，然而通過改變洗脫條件，可以讓目的成分和雜質有效分離，并不影響測定。酸液提取-堿化后有機溶劑萃取法的提取物中雖然雜質較少，但是操作復雜，步驟繁多。本研究旨在多品種間的橫向比較，故盡量采用簡便的操作辦法，回避操作誤差，因此本研究采用甲醇提取法。通過優化，采用1ml甲醇提取02g葉片干粉2次，操作可以縮小到2ml離心管內進行，便于大量操作。提取物濃度合適，通過適當增加進樣量，能夠保證含量較少的長春堿可以被檢測到。

在色譜條件的選擇中，流動相中甲醇和乙腈的比例對分離度和峰形均有較大影響，乙腈的增加有助于獲得良好的峰形，但當乙腈比例大于25%時，長春質堿會和樣品中的長春堿形成交叉，加入甲醇有助于兩者的分離。同時，在流動相中選擇二乙胺-磷酸溶液為緩沖體系，并通過調節溶液A與溶液B的比例使3種物質得到較好的分離。在實驗中，當A 的比例大于35%時，最后出峰的長春堿保留時間延長，當A的比例小于35%時，長春堿保留時間前移和樣品中極性大的雜質混出，難以得到滿意的分離度。因此，A∶B的比例在35∶65 時較為適宜。流動相的pH值對分離效果也有很大的影響，實驗以緩沖溶液調整流動相的pH值。將緩沖溶液的pH值分別設為50、60、70、72、74、76、和78，觀察pH值對峰形及分離效果的影響。結果表明：當緩沖溶液pH值為72時，各峰間分離度增大，峰形較好，出峰時間適宜。因此，選擇緩沖溶液pH值為72。

本研究利用RP-HPLC[8]方法對收集到的10種長春花品種中的文多靈、長春質堿和長春堿的含量進行分析，以期獲得長春花類生物堿含量高的品種。

1 儀器與試劑

11 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色譜工作站（美國Waters公司）；DL-720B型超聲水?。ㄉ虾Ｖ艃x器有限公司）；DHG-9075A型恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型電子天平（德國賽多利斯儀器公司）； PHS-3TC型pH計（上海天達儀器有限公司）；Ultrapure uvf純水儀（上海和泰儀器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋轉蒸發儀（上海魯伊工貿有限公司）。

12 試劑 文多靈批號2182-14-1，2100-2011；長春質堿批號2468-21-5，10605-2011；長春堿批號143-67-9，9011-2010，購自上海同田生物技術股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純， 二乙胺、磷酸為分析純，水為高純水。

13 材料 本實驗選用長春花購于美國泛美種子公司，包括太平洋系列品種5種，清涼系列品種2種，大力神系列品種3種。10種長春花藥材均種植于上海交通大學農業與生物學院農場。采用溫室大棚種植，溫度保持在20℃以上。于8月采集樣品，每個品種隨機選取3株，收集植株的葉子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；準確稱量干粉各05g，將同一品種的3份干粉混合均勻后保存于4℃冰箱備用。

2 實驗方法

21 標準品的配制 精密稱取三種標準樣品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超聲20min使之溶解后，定容至刻度，濃度為1mg/ml。經04μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。使用時根據需要用色譜純甲醇稀釋。

22 測試樣品的制備方法的選擇

221 提取溶劑的選擇 準確稱取同一樣品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分別精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超聲（功率600W，頻率99 kHz）提取30min，放冷，分別補加相應溶劑至刻度，搖勻，045μm微孔濾膜過濾，取續濾液10μl，注入液相色譜儀，測定。結果表明以甲醇作溶劑，文多靈、長春質堿、長春堿的提取率均高于其他溶劑，故本法采用甲醇作為提取溶劑。

222 提取方法的選擇 冷浸法：樣品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，離心后傾出上清液，重復3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；超聲法：1g樣品，加甲醇10ml，超聲半小時，離心后傾出上清液，重復3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；熱回流法：樣品1g，加10ml甲醇，60℃熱回流提取3次，合并提取液減壓蒸干，5ml甲醇定容。將3種方法提取液分別過045μm微孔濾膜，進樣10μl，測得熱回流和超聲法提取效率均高于冷浸法，考慮到試驗的可操作性和安全性，故選擇超聲法提取。

通過進一步的優化發現用5倍量的甲醇超聲2次，即能提取完全，超聲前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最終選定測試樣品制備方法為：精密稱取樣品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超聲30min，12000rpm離心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，離心，合并兩次的上清液，減壓干燥至恒重，1ml甲醇定容；經045μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

23 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色譜柱。流動相為A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸調整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱溫35℃；檢測波長：280nm；進樣量為40μl。文多靈、長春質堿、長春堿與相鄰色譜峰分離度均大于15，理論塔板數按三者的峰計算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范圍內。文多靈、長春質堿和長春堿的保留時間分別為9909、13819、17206min。

24 精密度試驗 取21項下標準品混合溶液，自動進樣器進樣40μl，重復6次，測得三種生物堿峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

25 穩定性實驗 精密吸取供試品液40μl，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定三種生物堿的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為140%、094%、161%，表明供試品液在24h內穩定。

26 重復性實驗 準確稱取同一樣品6份，每份02g，按照23項下色譜條件進行測定，三種生物堿的含量的相對標準偏差（RSD）分別為198%、145%、138%，表明方法重復性良好。

27 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（樣品1）3份，每份02g，分別加入上述混合標準品02，04，08ml，形成高、中、低3個濃度，依照上述方法進行樣品處理和測定，計算三種生物堿的回收率，結果平均回收率分別為10284%、9886%、9773%，RSD分別為135%、209%、245%，表明方法加樣回收率良好。

28 色譜峰純度分析 采用Empower 軟件系統對樣品中的文多靈，長春質堿和長春堿分析峰純度，峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖1） ，色譜峰純度角值小于閾值，表明吸收峰為光譜純。通過分別和文多靈，長春質堿，長春堿的標準品的光譜曲線匹配，亦匹配良好。

29 標準曲線 將上述標準品溶液稀釋至01μg/μl，用自動進樣器分別進樣5級標準：分別精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，上述色譜條件洗脫，測定峰面積。通過Empower軟件制作以文多靈，長春質堿，長春堿進樣量X（單位：μg）為橫坐標，峰面積Y（單位：微伏*秒） 為縱坐標繪制標準曲線。 文多靈回歸方程為Y=200×106X+546×104， r=09999，線性范圍為02～40μg。長春質堿回歸方程為Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍為02～40μg。長春堿回歸方程為Y=176×106X-717×104 ，r=09999，線性范圍為02～40μg。

3 實驗結果

按上述方法對10份長春花樣品進行測定。每批重復測定3次，結果見表1。

4 討論

在長春花樣品制備的方法中，常見的有甲醇提取法和酸液提取-堿化后有機溶劑萃取法[9]。通過比較發現，甲醇提取效率高，速度快，雖然提取物中含有較多雜質，然而通過改變洗脫條件，可以讓目的成分和雜質有效分離，并不影響測定。酸液提取-堿化后有機溶劑萃取法的提取物中雖然雜質較少，但是操作復雜，步驟繁多。本研究旨在多品種間的橫向比較，故盡量采用簡便的操作辦法，回避操作誤差，因此本研究采用甲醇提取法。通過優化，采用1ml甲醇提取02g葉片干粉2次，操作可以縮小到2ml離心管內進行，便于大量操作。提取物濃度合適，通過適當增加進樣量，能夠保證含量較少的長春堿可以被檢測到。

在色譜條件的選擇中，流動相中甲醇和乙腈的比例對分離度和峰形均有較大影響，乙腈的增加有助于獲得良好的峰形，但當乙腈比例大于25%時，長春質堿會和樣品中的長春堿形成交叉，加入甲醇有助于兩者的分離。同時，在流動相中選擇二乙胺-磷酸溶液為緩沖體系，并通過調節溶液A與溶液B的比例使3種物質得到較好的分離。在實驗中，當A 的比例大于35%時，最后出峰的長春堿保留時間延長，當A的比例小于35%時，長春堿保留時間前移和樣品中極性大的雜質混出，難以得到滿意的分離度。因此，A∶B的比例在35∶65 時較為適宜。流動相的pH值對分離效果也有很大的影響，實驗以緩沖溶液調整流動相的pH值。將緩沖溶液的pH值分別設為50、60、70、72、74、76、和78，觀察pH值對峰形及分離效果的影響。結果表明：當緩沖溶液pH值為72時，各峰間分離度增大，峰形較好，出峰時間適宜。因此，選擇緩沖溶液pH值為72。