H3N2 流感病毒冷適應株的無血清培養

郭 琦 耿興良 龍云鳳 楊 帆 宋紹輝 劉 婧 戴宗祥 姜述德 廖國陽

流感病毒是威脅人類健康的主要病原體之一。目前對于流感病毒的主要有效預防方法依然是接種流感疫苗［1］。流感減毒活疫苗能夠以與自然狀態下機體感染流感野毒株相同的機制引起機體產生長效的細胞免疫和體液免疫，使機體獲得交叉免疫保護的同時不會產生較明顯的感染癥狀［1～3］。鑒于雞胚生產流感病毒疫苗存在很多不足之處，WHO 推薦使用Vero 細胞作為流感疫苗的生產介質［4～8］。Vero 細胞培養流感病毒時，需要添加TPCK-胰酶裂解HA0 后病毒才能感染細胞。Vero 細胞培養使用的血清所含的類淀粉蛋白P，是甲型流感病毒表面唾液酰化糖蛋白的抑制劑，可通過影響TPCK 活性進而影響病毒的產量，同時血清作為培養基組分也存在較多弊端［6，9～12］。而無血清培養，既可戒除血清對流感病毒產量的影響，又能使后期工藝純化不受血清中復雜組分的左右［10，11，13］。故本實驗對無血清條件下培養H3N2 流感病毒冷適應株的適宜條件進行了探索。

材料與方法

1.材料：無血清培養的Vero 細胞( SFM-Vero) 第140 代，甲型流感病毒冷適應株A/Yunnan/1/2005 Vca ( H3N2) ，均由中國醫學科學院醫學生物學研究所生物制品五室保存。TPCK-胰酶( Worthington 公司) ； BSA( 北京鼎國生物公司) ；DMEM/F12 和RPMI-1640 培養基( 美國Thermo 公司) ；MEM基礎培養基由醫學生物學研究所溶液組配制；帶FITC 標記的兔抗山羊綠色熒光抗體( BD 公司) 。BeckmanG25 離心機( Beckman 公司) ；細胞培養瓶、血凝板( Nunc 公司) ；細胞培養箱( 賓德公司) ；H-7650 透射式電子顯微鏡( 日立公司) 。

2.實驗方法：( 1) 冷適應株H3N2 對無血清Vero 細胞的感染性檢測：使用SFM -Vero 細胞鋪至細胞爬片。培養24h后接種病毒，設立陰性對照孔。先后加多聚甲醛溶液、Triton-100、甲醇及BSA 溶液。加羊抗H3N2 血清及FITC 標記兔抗羊抗體孵育后封片觀察。( 2) 無血清培養流感病毒冷適應株H3N2 的條件優化：①接種病毒胞齡的選擇：使用MTT法在波長490nm 處測定吸光度值( A) ，按照均數± 標準差(±s) 求出區間，剔除不在此區間的A490值，求得平均值后，繪制細胞生長曲線，根據曲線選取不同點接種病毒，確定適合流感病毒冷適應株增殖的適宜細胞胞齡［10］；②基礎培養基的的選擇：分別以DMEM/F12、1640、MEM∶ DMEM/F12(1∶1) 的混合液、MEM 為基礎培養基培養病毒，每個條件做4 個平行，(25.0 ±0.5) ℃培養相同時間后收獲病毒液，測定其血凝效價［14］；③pH 值對流感病毒產量的影響：使用DMEM/F12 配制病毒培養液，調整病毒培養液pH 分別為6.89、7.15、7.37、7.64、7.84、7.97 培養H3N2 流感病毒相同時間后測定血凝效價；④BSA-TPCK 胰酶添加量對流感病毒產量的影響： 以組合的方式向病毒培養液中添加不同含量的BSA 和TPCK 胰酶，培養相同時間后收獲病毒并測定血凝效價；⑤病毒培養過程中TPCK 胰酶補加時間及補加量的優化： 分別在病毒培養的24、48、72、96h 補加TPCK 胰酶，每次均按照0.3、0.6、1.0、1.3μg/ml 的終濃度分別進行補加，培養相同時間后測定病毒血凝效價；⑥病毒接種量對其產量的影響：在之前優化的條件下，分別按照MOI 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 的量接種流感病毒，培養相同時間后測定血凝效價，確定適宜接種量； ⑦病毒收獲時間的確定：按優化出來的條件培養病毒，每隔12h 進行取樣，測定病毒的血凝效價，繪制病毒大致的增殖曲線，并依此來進一步優化病毒的收獲時間；⑧病毒完整性檢測：使用電子顯微鏡對無血清培養的H3N2 流感病毒冷適應株進行形態觀察，并與10%血清培養的病毒形態進行對比。

結 果

1.病毒侵染性實驗： 免疫熒光實驗顯示，被流感病毒感染的細胞呈現出綠色熒光，陰性對照基本不顯示熒光。說明H3N2 流感病毒冷適應株可以在無血清培養基培養的Vero 細胞中增殖( 圖1) 。

圖1 冷適應株H3N2 流感病毒在SFM-Vero細胞上的免疫熒光( ×100)

2.H3N2 流感病毒冷適應株培養條件的優化：(1) 細胞胞齡的選擇： 依據生長曲線，分別在細胞培養的12、24、36、48h 接種流感病毒，培養相同時間后測定病毒血凝效價［11］。結果顯示胞齡為36h 接種培養出來的病毒效價最高，為1∶256。( 表1) 。( 2) 基礎培養基的選擇： 以DMEM/F12 為基礎培養基培養病毒時，病毒效價為1∶240 均比其他培養基高，確定DMEM/F12 為基礎培養基( 表2) 。(3) 病毒培養液pH 值的確定：本實驗表明，當培養液的pH 值呈現弱堿性即pH 值為7.15 ～7.64 時，培養出的病毒血凝效價最高為1∶240( 表3) 。( 4) BSA 和TPCK 胰酶添加量對流感病毒產量的影響：通過測定病毒收獲液的血凝效價后發現，BSA 和TPCK 胰酶添加的終濃度均在0.8 ～1.2μg/ml，可達到1∶224( 表4) 。(5) TPCK胰酶補加量和補加時間對流感病毒產量的影響：病毒培養96h 后按照1μg/ml 終濃度補加TPCK 胰酶，病毒效價最高為1 ∶256，測定血凝效價結果( 表5) 。(6) 接種量對病毒產量的影響： 培養條件得到初步的優化以后，病毒的接種量也是影響病毒產量的一個重要因素。從培養結果看，流感病毒接種量在0.05 ～0.10MOI 時，病毒效價最高可達1∶256 且穩定。( 7)病毒收獲時間的確定：繪制出病毒大致的增殖曲線如圖3。確定病毒的收獲時間為168h，血凝效價最高，為1∶256。(8) 病毒完整性檢測：如圖4 所示，無血清條件下培養出的流感病毒輪廓清晰，形態完整。與對照中10%血清培養的病毒相比，形態差異無統計學意義。

圖2 細胞生長曲線

表1 不同胞齡的SFM-Vero 細胞接種H3N2 流感病毒后的平均血凝效價

表2 不同基礎培養基對病毒效價的影響

表3 不同pH 值對病毒效價的影響

表4 TPCK 胰酶和BSA 添加量對病毒效價的影響

表5 不同時間補加不同量的TPCK 胰酶后的病毒效價

圖3 病毒增殖曲線

圖4 不同血清條件培養的H3N2 流感病毒的形態( ×15000)

討 論

流感病毒減毒活疫苗能夠引起機體持久而多樣的免疫反應，為流感的預防提供了新思路［15］。目前主要使用流感病毒冷適應株，溫敏株或是復制缺陷株作為減毒活疫苗備選株［16］。已上市的減毒活疫苗均是以雞胚為介質生產的，而使用細胞生產減毒活疫苗仍在研發中。Vero 細胞培養流感病毒時，需添加TPCK 胰酶裂解流感病毒HA0 蛋白，促進流感病毒吸附在細胞表面，使其能夠有效增殖［11］。常規細胞培養中殘留的血清成分會影響TPCK 胰酶的活性，從而影響流感病毒的產量。無血清細胞培養技術無疑是流感病毒減毒活疫苗制備的最佳選擇，美國百特公司亦使用該技術培養流感病毒。本研究對H3N2 流感病毒冷適應株的無血清培養條件進行優化。

免疫熒光實驗顯示H3N2 流感病毒冷適應株對無血清培養的Vero 細胞有感染性，為此對其無血清培養條件進行初步優化。細胞培養36h 后接種病毒，所得病毒效價較高，此時細胞剛生長成致密的單層，且細胞活力高，對流感病毒敏感。培養時間短于36h，細胞對TPCK 胰酶的耐受力較低；超過36h，由于胞齡過長，細胞對病毒的敏感度下降，最終均影響病毒產量。同時，實驗優選出DMEM/F12 為病毒培養的基礎培養基。病毒培養液的pH 值為7.15 ～7.64時既不影響細胞狀態又不影響TPCK 胰酶活性，較適合病毒增殖。此外BSA 作為培養液中的重要成分可單獨或與TPCK 胰酶共同影響病毒產量。當BSA 和TPCK 胰酶的添加終濃度均為0.8 ～1.2μg/ml 時，病毒效價較高。培養過程中由于培養液pH 值的變化，TPCK 胰酶的活性受到影響，病毒再次感染受限。病毒培養96h 后補加終濃度為1μg/ml 的TPCK 胰酶能得到較高效價的病毒。過早補加TPCK 胰酶，會影響細胞生長狀態。

除培養條件外，病毒接種量也是影響病毒產量的重要因素。病毒的接種量低，不能完全感染細胞； 接種量太高，則會形成缺陷干擾顆粒( defective interfering particles，DIP)，影 響 病 毒 正 常 感 染［11］。接 種0.05 ～0.10 MOI 的病毒，培養168h 后收獲病毒效價最高。病毒培養時間過短，病毒未完全從感染的細胞中釋放，病毒產量較低；培養時間過長，病毒易降解。

綜上所述，本研究在確認了H3N2 流感病毒冷適應株在無血清適應的Vero 細胞上的感染性后初步優化了其無血清培養的條件，為安全有效的流感減毒活疫苗的生產和研發提供了依據。

1 Lanthier PA，Huston GE，Moquin A，et al. Live attenuated influenza vaccine ( LAIV) impacts innate and adaptive immune responses［J］.Vaccine，2011，29(44) ： 7849 -7856

2 Barrett PN，Portsmouth D，Ehrlich HJ. Vero cell culture - derived pandemic influenza vaccines： preclinical and clinical development［J］. Expert Review of Vaccines，2013，12(4) ： 395 -413

3 Belshe R，Lee M-S，Walker RE，et al. Safety，immunogenicity and efficacy of intranasal，live attenuated influenza vaccine［J］. Expert Review of Vaccines，2004，3(6) ： 643 -654

4 Murakami S，Horimoto T，Ito M，et al. Enhanced growth of influenza vaccine seed viruses in vero cells mediated by broadening the optimal pH range for virus membrane fusion［J］. Journal of Virology，2012，86(3) ： 1405 -1410

5 Tree JA，Richardson C，Fooks AR，et al. Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains［J］. Vaccine，2001，19(25 -26) ：3444 -3450

6 Hu AY，Tseng YF，Weng TC，et al. Production of inactivated influenza H5N1 vaccines from MDCK cells in serum - free medium［J］.PLoS One，2011，6(1) ： e14578

7 Kistner O，Barrett PN，Mundt W，et al. Development of a mammalian cell ( Vero) derived candidate influenza virus vaccine［J］. Vaccine，1998，16(9 -10) ： 960 -968

8 Organization WH. Cell culture as a substrate for the production of influenza vaccines： memorandum from a WHO meeting［J］. Bulletin of the World Health Organization ( WHO) ，1995，73(4) ： 431 -435

9 Job ER，Bottazzi B，Gilbertson B，et al. Serum amyloid P is a sialylated glycoprotein inhibitor of influenza A viruses［J］. PloS one，2013，8(3) ： e59623

10 耿興良，戴宗祥，段盼盼，等. Vero 細胞培養流感病毒的低血清培養基的篩選［J］. 中國生物制品學雜志，2014，27( 5) ： 687 -690

11 劉錚，孫明波，高菁霞，等. 低血清培養Vero 細胞和流感病毒條件的優化［J］. 中國生物制品學雜志，2009，22(6) ： 593 -595

12 Butler M. Serum-free media： standardizing cell culture system［J］.Pharmaceutical Bioprocessing，2013，1(4) ： 315 -318

13 田石華，孫明波，張新文，等. 無血清微載體培養Vero 細胞和H1N1 流感病毒條件的優化［J］. 中國生物制品學雜志，2010，23(6) ： 639 -642

14 唐靜，馬磊，周芳燁，等. 流感病毒快速診斷試劑中HA 抗原熱穩定性的研究［J］. 安徽農業科學，2012，40(16) ： 8935 -8936

15 Tlaxca JL，Ellis S，Remmele RL. Live attenuated and inactivated viral vaccine formulation and nasal delivery： potential and challenges［J］. Advanced Drug Delivery Reviews，2014：1 -23

16 Zheng D，Yi YL，Chen Z. Development of live-attenuated influenza vaccines against outbreaks of H5N1 influenza［J］. Viruses，2012，4(12) ： 3589 -3605