人生長素對雌性大鼠心力衰竭心臟重塑及心肌細胞凋亡的影響

孫宇澤 李艷麗 趙 勇 袁 寰 田國忠 李梅秀

各種病因所致心力衰竭( HF) 嚴重威脅人類的健康。AMI 發生率不斷升高與患者逐漸年輕化的趨勢使之成為制約現代人生活質量的主要元兇［1，2］。GHRPs 是20 世紀70 年代合成的可以強烈促進生長激素( growth hormone，GH) 釋放的一族寡肽，與同樣作用的非肽類化合物被合稱為生長激素促分泌素( growth hormone secretagogues，GHSs)［3］。GHRPs 受體即GHS-R 的成功克隆，不僅使其代謝生長調節等內分泌功能廣為關注外，也因其不依賴于GH 軸的廣泛生物學活性特別是GHRPs 的心血管保護效應越來越受到醫學工作者的重視［4］。GHS -R 發現后隨之發現了內源性的配基天然ghrelin，又稱生長素［5，6］。至此，這族GHS 被冀望于新世紀HF 生物學治療的最有前途的遴選藥物。ghrelin 由28 個氨基酸組成，是一種新的GHRPs，最初是從大鼠的胃壁組織中作為GHS-R 的配體被確認并提取，其功能不僅是GH 軸的調節，還因通過其廣泛分布中樞和外周而發揮獨立于GH 軸的生物活性，進來，生長素的心臟保護效應正在受到日益矚目，而其細胞及分子機制的研究及可能的臨床試用成為目前研究的重點［6］。為此，在本課題組及其他課題組初步探究了人ghrelin 對AMI 雄性大鼠影響基礎上，設計以AMI 誘導成年雌性Wistar大鼠HF 模型，探索人ghrelin 對雌性HF 大鼠心肌重塑、細胞凋亡的影響，為GHRPs 應用于HF 生物學治療、為人內源性ghrelin 作為HF 生物學治療的新靶點進入臨床應用提供必要的實驗資料。

材料與方法

1.實驗動物：成年健康雌性Wistar 大鼠，平均體質量280±30g，共50 只，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，適應性飼養后按體重隨機分為正常組( A 組) 、假手術組( B 組) ，其余用于AMI 模型制作，符合標準的再分為單純AMI 致HF 模型組( C 組) 和HF+人ghrelin 組( D 組) 。

2.主要儀器和試劑：RM6240 多道生理信號采集處理系統( 成都儀器廠) ； 小動物呼吸機3 臺： HX -300、HX -300S( 成都泰盟科技有限公司) ；DHX-150( 成都儀器廠) ；YC -6C 生物組織攤烤片機( 湖北省孝感市亞光醫用電子技術研究所) ；LEICA CM 1100 冷凍切片機( 德國) ；LEICA SM 2000R 滑動式切片機( 德國) ，Nikon YS100 生物顯微攝像和分析系統( 日本) 。人ghrelin( 以色列) ，TUNEL 凋亡檢測試劑盒( Roche 公司) ，其他試劑為國產試劑純。

3.建立AMI 大鼠模型及分組處置： 于平左心耳下緣水平結扎LAD，在RM6240 多道生理信號采集處理系統大鼠胸前第Ⅱ導聯檢測心肌供血變化，以ST-T 段顯著、持續抬高為結扎成功、以B 型超聲檢測左心室射血分數( ejection fraction，EF) ＜45%為達到HF。不符合條件的非標準模型淘汰后： D組給人ghrelin 40μg/( kg·d) 經尾靜脈注射進行干預3 周。麻醉下取材心肌梗死部位左心室心肌組織經4%多聚甲醛固定后分別嚴格按照TUNEL 試劑盒說明和HE 染色步驟進行操作，封片干燥后Nikon YS100 生物顯微鏡下觀片并拍攝。心肌細胞凋亡指數( apoptotic index，AI) 以不重疊的7 個視野計數，AI( %) =凋亡細胞數÷細胞總數×100%。

結 果

1.AMI 致HF 模型制作ECG 結果： RM6240 多道生理信號采集處理系統AMI 模型制作結扎LAD 術中大鼠胸前Ⅱ導聯即時監測心肌供血變化，結扎后STT 段弓背向上持續抬高即為AMI 制作成功，經B 型超聲5 個心動周期檢測EF ＜45%為可用HF 大鼠模型，用于后續實驗，假手術ST -T 段不明顯抬高或一過性升高并迅速回落為成功。

2.ghrelin 對AMI 致HF 心肌結構的影響HE 檢測結果：HE 染色可見HF 即C 組與B 組比較，心肌細胞大部分腫脹、著色極為不均、顆粒變性、細胞核固縮多、心肌排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤、間質纖維化；而ghrelin 干預的D 組則心肌細胞也有腫脹但范圍明顯減小、粒細胞浸潤及間質纖維化均較輕、著色較均勻； 與A 組比較，B 組心肌組織著色、心肌纖維排列、炎性細胞浸潤等均未見明顯差異( 圖1) 。

圖1 HE 染色檢測心肌組織結構( HE，×400)

3. ghrelin 對AMI 致HF 心肌細胞凋亡影響TUNEL 檢測結果： TUNEL 染色可見HF 即C 組與B組比較，心肌細胞細胞核被染成棕褐色呈現大量特異性凋亡、可見大量炎性細胞浸潤；而ghrelin 干預的D組則見較少特異性細胞凋亡； 與A 組比較，B 組未見特異性細胞凋亡見圖2。D 組與C 組凋亡指數比較明顯降低，差異具有統計學意義( P ＜0.05) ，表1 中列出B、C、D 組心肌細胞凋亡指數( AI) 。

圖2 TUNEL 染色檢測心肌組織細胞凋亡檢測( TUNEL，×400)

表1 AMI 致HF 大鼠心肌細胞凋亡指數及ghrelin 對其影響(±s，%)

表1 AMI 致HF 大鼠心肌細胞凋亡指數及ghrelin 對其影響(±s，%)

組別 假手術組( B 組)HF 模型組( C 組)HF+人ghrelin 組( D 組)AI 7.3 +1.5 39.3 ±1.5*31.3 ±1.2

討 論

隨著時代的進步和經濟的快速發展，人們的生活發生著日新月異的變化，生活節奏的加快滋生了生活方式疾病，新的疾病譜也應運而生，人類的健康與保健意識、措施也在相應變化。一方面壽命延長，讓中國逐步進入了老齡化社會，因HF 是各種心臟疾病的終結歸宿，其復雜性、嚴重性都注定了HF 的治療是一項耗費巨大的醫療支出； 同時，出現了許多老年致命疾病發病年齡提前、發生率逐年升高的趨勢。AMI是最常見的危重心臟病，其發病年輕化且高發的趨勢是現代直接危害中青年骨干人群健康的元兇［1，7，8］。AMI 瞬間斃命的結局引起相當惡劣的社會效應，亟需醫學工作者為中青年及老年人的AMI 患病風險及早做出預警，并在發病后提供最有效的挽救生命的措施，因此，這是一個多元化需求的新醫療時代［9］。所以，對AMI 的預防、搶救的新攻略研究迫在眉睫。AMI 后心肌組織因缺血壞死不僅急劇加重原有心臟病病情導致心功能驟然下降至HF，而且還因大面積心肌梗死直接誘發HF，因此，AMI 可作為一種較理想的HF 誘導方法［10］。

多數研究避開雌雄性別差異而選擇雄性為研究對象，但雄性對象研究結果并不能完全替代雌雄研究資料。有研究結果證明男性、女性在AMI 乃至其后的HF 發生率方面存在顯著差異［11］。GHRPs 及人和哺乳動物體內共有的天然生長素即ghrelin，通過其廣泛分布的心血管系統特異受體，發揮著生長激素-胰島素軸以外的心血管保護效應，被視為新世紀最有前途的HF 生物學治療遴選藥物［12～15］。因此，亟需大量實驗研究全面闡述其心臟保護活性機制，然而，即使使用雌性大鼠研究AMI 后HF 觀察的亦是大鼠天然生長素的作用，而缺少對人類天然生長素生物學效應及機制的實驗資料，制約了人ghrelin 作為HF 生物學治療新靶點應用于臨床的步伐［12］。

本實驗即是通過較高位置結扎LAD 使得成年雌性大鼠心功能急劇下降至＜45%直接誘導HF，HF 后大鼠心臟結構發生代償性重構變化即心肌纖維化。本實驗心肌組織HE 染色結果證實了AMI 后誘導的HF 心臟發生結構重塑，顯示了增加外源性的GHRPs即給人天然ghrelin 能夠減輕HF 心臟的結構重塑；TUNEL 染色結果又復證明了AMI 致HF 后的心臟大量心肌細胞凋亡及人ghrelin 抑制HF 心臟心肌細胞凋亡的發生，與課題組前期完成的研究補充了ghrelin對AMI、HF 大鼠的作用部分實驗資料，為進入臨床發揮HF 生物學治療作用提供有力佐證［16］； 性別差異在AMI 乃至HF 病理進程中的差異及內源性ghrelin的變化有待于今后進一步研究，雄性大鼠AMI 致HF模型及相關項目研究業已完成，二者之間的比較及其他實驗數據發表待后續完成。

1 Altowaijri A，Phillips CJ，Fitzsimmons D.A systematic review of the clinical and economic effectiveness of clinical pharmacist intervention in secondary prevention of cardiovascular disease［J］. Manag Care Pharm，2013，19(5) ：408 -416

2 Yunyun W，Tong L，Yingwu L，et al. Analysis of risk factors of STsegment elevation myocardial infarction in young patients［J］. BMC Cardiovasc Disorders，2014，14：179 -188

3 Bowers CY，Momany F，Reynolds GA，et al. Structure activity relationships of a synthetic pentapeptide that specifically releases growth hormone in vitro［J］. Endocrinology，1980，106：663 -667

4 Howard AD，Feighner SD，Gully DF，et al. A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release［J］. Science，1996，273：974 -977

5 Kojima M，Hosoda H，Date Y，et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach ［J］. Nature，1999，402：656 -660

6 陳晨，孫強. 生長素的發現及研究進展［J］. 西安交通大學學報：醫學版，2009，30(2) ：131 -136

7 White HD，Chew DP. Acute myocardial infarction. Lancet，2008，16；372：570 -584

8 Fan GQ1，Fu KL1，Jin CW1，et al. A medical costs study of older patients with acute myocardial infarction and metabolic syndrome in hospital. Clin Interv Aging，2015，23(10) ：329 -337

9 Gambetti S，Fuca G，Bressan S，et al.Focal acute myocarditis mimicking ST-elevation myocardial infarction： a case report and literature review.Ital Cardiol ( Rome) .2014，15(11) ：634 -637

10 Haidara MA，Assiri AS，Z Yassin H，et al. Heart Failure Models：Traditional and Novel Therapy. Curr Vasc Pharmacol，2015 Feb 12

11 Konstantino Y，Chen E，Hasdai D，et al. Gender differences in mortality after acute myocardial infarction with mild to moderate heart failure. Acute Card Care，2007，9(1) ：43 -47

12 Chunyan Yang，Zhonghui Liu，Kai Liu，et al. Mechanisms of Ghrelin anti-heart failure： inhibition of Ang Ⅱ-induced cardiomyocyte apoptosis by down - regulating AT1R expression. PLoS One，2014，9(1) ：e85785

13 Ong H，Bodart V，McNicoll N，Lamontagne D，Bouchard JF. Binding sites for growth hormone - releasing peptide. Growth Horm IGF Res，1998，8： 137 -140

14 CHEN Chen，孫強. 生長素的發現及研究進展. 西安交通大學學報，2009，30(2) ：131 -136

15 Leite Moreira AF，Soares JB. Physiological，pathological and potential therapeutic roles of ghrelin ［J］. Drug Discov Today，2007，12：276 -288

16 韓峰，田國忠，李梅秀.AMI 大鼠Ghrelin 的變化及人Ghrelin 對其影響［J］.黑龍江醫藥科學，2014，37(3) ：1 -3