基于紅細胞溶血貧血探討地中海貧血患者證候季節變化的生物學機制

褚娜利 張新華 方素萍 程艷玲 王文娟 吳志奎

地中海貧血是先天性基因缺陷致使人體不能正常合成血紅蛋白珠蛋白引起的一種遺傳性血液病，也叫珠蛋白合成障礙性貧血［1］。地中海貧血由于血紅蛋白珠蛋白基因缺陷而導致肽鏈失衡，使得過剩的珠蛋白肽鏈沉積于紅細胞膜，出現免疫損傷，誘發氧自由基反應，繼發性酶和代謝異常，導致紅細胞變形和機械穩定性下降，最終導致溶血和無效造血，引起一系列臨床綜合征［2］。最近研究發現，地中海貧血患者在不同的季節病情的嚴重程度不同，夏季溶血嚴重，冬季有所緩解，地中海貧血嚴重程度與季節變化有關［3，4］。為進一步證實地中海貧血患者在氣溫高的季節( 夏季) 比氣溫低的季節( 冬季) 溶血貧血嚴重，并探討證候季節變化的生物學機制，吳志奎課題組于夏季(7 月份) 和冬季( 11 月份) 對11 例地中海貧血患者，觀察冬夏兩個月份地中海貧血患者血液參數和中醫證候量化評分水平的差異，并檢測冬夏兩個月份紅細胞溶血貧血相關指標水平差異，初步探討地中海貧血患者證候季節變化的生物學機制，現報告如下。

資料與方法

1.診斷標準：西醫診斷標準按照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》中地中海貧血的診斷標準進行診斷。中醫辨證診斷標準及辨證標參照《中西醫臨床血液病學》和《中藥新藥臨床研究指導原則》［5～7］。

2.病例納入、排除標準： 病例納入標準： ①符合中間型地中海貧血西醫診斷者；②符合中醫肝腎陰虛、精血不足證辯證標準者；③年齡3 ～40 歲。病例排除標準：①伴免疫缺陷，肝、腎及血液系統其他原發性疾病者；②妊娠婦女；③近2 個月內服用其他抗貧血藥者。

3.一般資料：11 例中間型地中海貧血患者(5 例α -地中海貧血、6 例β-地中海貧血) 均為就診于中國人民解放軍第303 醫院的門診病例。11 例地中海貧血患者男性7 例，女性5例；患者年齡9 ～26 歲，平均年齡14.73 ±5.87 歲；壯族7 例，漢族4 例。11 例地中海貧血患者的籍貫均為廣西籍。

4.觀察指標與方法：(1) 主要血液參數的檢測：檢測冬夏11 例地中海貧血患者血液參數［血紅蛋白( Hb) 、紅細胞( RBC) 、網織紅細胞( Ret) ］的水平。(2) 中醫證候量化評分：觀察冬夏11 例患者的中醫證候( 頭暈目眩、爪甲色淡、倦怠乏力、食少納呆、潮熱盜汗、腰酸腿軟) 并按課題組制定的《中醫證候量化評分表》進行中醫證候量化評分［8］。(3) 外周血細胞因子活性的檢測：檢測冬夏11 例患者血清中造血細胞因子包括干細胞因子( SCF) 、白細胞介素-3( IL -3) 的含量。采用欣博盛公司ELISA 試劑盒檢測SCF、IL -3［SCF( EHC153.96) 批號：H140311 -53a；IL-3( EHC005.96) 批號：H140218 -13b］的含量；采用華美生物公司human EPO 試劑盒檢測EPO［EPO( 貨號： CSB - E04538H) 批號： C0302200354］的含量。(4) 紅細胞抗氧化損傷水平的檢測：檢測冬夏11 例患者紅細胞中抗氧化損傷指標包括超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH -Px) 的含量。采用南京建成生物工程研究所生產的超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px) 試劑盒［SOD( A001-3) 批號：20140321； MDA( A003 -1) 批號：20140321； GSH -Px( A005) ；批號：20140321］。(5) 紅細胞膜骨架蛋白的檢測：檢測冬夏11 例患者紅細胞膜骨架蛋白α - 收縮蛋白( SPTA1) 、β-收縮蛋白( SPTB) 、帶4.1 蛋白( EPB4.1) 的表達差異，用RNeasy Mini Kit( 50) 試劑盒( lot. no. 145039452、145047200) 提取單核細胞中的mRNA，經反轉錄合成cDNA，以β-actin 為內參；引物有北京賽百盛生物科技有限公司合成，PCR 引 物 序 列 為： β- actin： 上 游 引 物： 5' - GAGACCTTCAACACCCCAGCC - 3'，下 游 引 物： 5' - AATGTCACGCACGATTTCCC-3'； SPTA1： 上游引物：5' - GATCTTGAAGCCAATGTCCA-3'，下游引物：5' -CAACTCCCTCCACTGGTG -3'；SPTB：上游引物：5' -AACCGGGATAAGGTCTTGAGTC-3'，下游引物：5' -GGTGCTTTAGCCATTTATTGTGA -3'；EPB4.1：上游引物：5' -TTATCCACTCACTCACCCTTCC-3'，下游引物：5' - CTCACTAGCAATCTCGGTCTCC - 3'； PCR 產 物 的 檢 測：1.2%瓊脂糖電泳，溴化乙錠( EB) 染色法檢測。檢測條件：電壓100V，擴增產物在紫外燈下觀察，呈紅棕色熒光帶。

5.統計學方法：采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s) 表示，比較采用兩獨立樣本t 檢驗。所有的統計檢驗均采用雙側檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.11 例地中海貧血患者冬夏兩季血液參數水平比較：表1 示，冬季(11 月份) 地中海貧血患者Hb 水平顯著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.05) ，RBC、Ret 冬夏兩個月份水平差異無統計學意義( P ＞0.05) 。

表1 11 例地中海貧血患者冬夏兩季血液參數水平比較(±s)

表1 11 例地中海貧血患者冬夏兩季血液參數水平比較(±s)

與夏季比較，* P ＜0.05

時間 n Hb ( g/L) RBC ( ×1012/L) Ret ( %)11 79.17 ±9.72 3.94 ±0.97 5.36 ±2.92冬季 11 87.83 ±12.10*夏季4.03 ±0.85 4.26 ±0.85

2.11 例地中海貧血患者冬夏兩季中醫證候量化評分水平的比較：表2 示，冬季(11 月份) 地中海貧血患者爪甲色淡、食少納呆、潮熱盜汗的中醫證候量化評分顯著低于夏季( 7 月份) ( P ＜0.05) ； 頭暈目眩、倦怠乏力、腰膝酸軟中醫證候量化評分冬夏兩個月份比較，差異無統計學意義( P ＞0.05) 。

表2 11 例地中海貧血患者冬夏兩季中醫證候量化評分水平比較(±s)

表2 11 例地中海貧血患者冬夏兩季中醫證候量化評分水平比較(±s)

與夏季比較，* P ＜0.05

時間 頭暈目眩 爪甲色淡 倦怠乏力 食少納呆 潮熱盜汗 腰酸腿軟夏季 0.58 ±1.16 3.08 ±2.47 2.09 ±2.34 2.09 ±2.17 4.0 0 ±3.19 0.64 ±1.43冬季 0.50 ±0.52 2.17 ±1.34* 1.64 ±2.20 0.91 ±1.45* 1.18 ±1.47*0.55 ±1.21

3.11 例地中海貧血患者冬夏兩季抗氧化損傷水平的比較：表3 示，冬季(11 月份) 紅細胞抗氧化損傷指標SOD、GSH-Px 活性顯著低于夏季( 7 月份) ( P＜0.01) ，MDA 的活性顯著高于夏季( 7 月份) ( P ＜0.01) 。

表3 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細胞抗氧化損傷水平(±s)

表3 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細胞抗氧化損傷水平(±s)

與夏季比較，* P ＜0.01

時間 n SOD( U/gHb) MDA ( nmol/mg) GSH-Px ( U/gHb)11 7347.42 ±402.29 1.29 ±0.39 192.52 ±7.82冬季 11 5248.37 ±546.11* 2.55 ±0.74* 161.33 ±15.54夏季*

4.11 例地中海貧血患者冬夏兩季造血相關細胞因子水平比較：表4 示，冬季(11 月份) 血清造血細胞因子SCF、EPO 水平顯著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.01或P ＜0.05) ，IL-3 活性水平冬季( 11 月份) 顯著低于夏季(7 月份) ( P ＜0.05) 。

表4 11 例地中海貧血患者冬夏兩季造血相關細胞因子水平比較(±s)

表4 11 例地中海貧血患者冬夏兩季造血相關細胞因子水平比較(±s)

與夏季比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

時間 n SCF( pg/ml) IL-3( pg/ml) EPO( mIU/ml)11 56.78 ±8.69 64.11 ±19.39 3.72 ±1.61冬季 11 65.69 ±4.67＊＊ 47.55 ±8.54* 5.31 ±0.89夏季*

5.11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細胞膜骨架蛋白表達水平比較：表5 示，冬季(11 月份) 地中海貧血患者紅細胞膜骨架蛋白SPTA1 mRNA 的表達水平顯著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.05)，SPTB、EPB4.1 冬夏兩個月份的mRNA 的表達水平差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表5 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細胞膜骨架蛋白表達水平比較(±s)

表5 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細胞膜骨架蛋白表達水平比較(±s)

Ct 值為熒光檢測的域值與基因的表達量呈反比，與夏季比較，* P＜0.05

時間 n SPTA1/β-actin( Ct)SPTB/β-actin( Ct)EPB4.1/β-actin( Ct)11 2.18 ±0.30 1.88 ±0.21 1.82 ±0.19冬季 11 1.95 ±0.32*夏季1.80 ±0.25 1.68 ±0.25

討 論

地中海貧血( thalassaemia) 也叫珠蛋白生成障礙性貧血，是世界范圍內發生率高、危害最大的單基因遺傳病。最近研究發現，地中海貧血患者在不同的季節病情的嚴重程度不同，夏季溶血嚴重，冬季有所緩解，地中海貧血病情嚴重程度與季節變化有關。2006年吳志奎等［9］在廣西高發區對112 例中間型地中海貧血患者進行了中醫證候量化評分、辨證分型，發現中間型地中海貧血患者病情嚴重程度與季節變化有關，其證候變化特點是：基本證型未變，但臨床癥狀有明顯的季節改變( 夏季肝腎陰虛加重： 頭暈目眩、潮熱盜汗耳鳴、惡熱等癥狀明顯加重) 。

2012 年吳志奎課題組在廣西高發區在夏季(7 月份) 和冬季(11 月份) 分別收集HbH 病患者31 例和35 例，進一步觀察地中海貧血患者證候季節變化的客觀規律，研究發現影響地中海貧血患者主要癥狀的血液參數Hb 水平，冬季組HbH 病患者顯著高于夏季，冬季組HbH 病患者大多數中醫證候如面色萎黃、爪甲色淡、耳鳴、口咽干燥的量化評分顯著低于夏季組，說明患者夏季比冬季病情嚴重，與冬夏兩組患者臨床血液參數水平結果一致，進一步證實了HbH 病患者病情嚴重程度存在季節變化。地中海貧血患者的證候季節變化體現了中醫“天人合一”四時陰陽的整體觀。地中海貧血患者血液參數的季節改變、溶血貧血嚴重程度的季節變化，影響患者臨床中醫證候特異性組合的改變，這種證候的季節變化可能與一些和溶血相關的生物大分子的活性、表達、代謝及紅細胞膜結構與功能等相關的生物標志物群的季節性改變有關。有研究顯示地中海貧血患者夏季病情嚴重的機制可能為夏季高溫天氣下，血容量增加導致內源性血液稀釋［10］。但季節性氣溫變化對地中海貧血患者臨床癥狀影響的程度和血液參數呈現季節性變化的生物學機制到底是什么，目前仍鮮有報道。本研究擬從季節對地中海貧血患者紅細胞溶血貧血影響的角度探討證候季節變化的生物學機制，從一個側面揭示地中海貧血證候季節變化的生物學機制。

本研究結果顯示，影響地中海貧血患者主要癥狀的血液參數Hb 水平，冬季( 11 月份) 地中海貧血患者Hb 水平顯著高于夏季( 7 月份) 。通過對冬夏兩組患者中醫證候量化評分，發現冬季(11 月份) 地中海貧血患者大多數中醫證候如爪甲色淡、食少納呆、潮熱盜汗的量化評分顯著低于夏季，說明患者夏季比冬季病情嚴重，與冬夏兩個時間節點主要的臨床血液參數Hb 水平結果一致，進一步證實了地中海貧血患者病情嚴重程度存在季節變化。地中海貧血患者溶血貧血的一個重要原因是紅細胞對氧化損傷非常敏感［11］。

MDA 是機體內脂質過氧化損傷的生物標志物［12］。SOD 和GSH -Px 是機體抵抗氧化損傷的重要物質［13，14］。Dhawan 等［13］研究β -地中海貧血純合子患者抗氧化損傷狀態，發現患者SOD 活性與Hb水平呈負相關，說明隨著患者病情嚴重程度加重SOD水平代償性的升高。Filiz 等［15］研究發現地中海貧血患者SOD 和GSH -Px 活性與正常人相比升高，認為是機體的代償機制。

本研究發現，冬季( 11 月份) 紅細胞抗氧化損傷指標SOD、GSH - Px 活性顯著低于夏季( 7 月份) ，MDA 的活性顯著高于夏季( 7 月份) ，患者機體由于SOD、GSH-Px 的代償作用使得夏季( 7 月份) MDA的含量低于冬季(11 月份) ，說明夏季患者病情嚴重程度比冬季重，激發患者代償作用清除體內過多的氧化產物。相對過剩的珠蛋白鏈沉積在紅細胞膜上，與紅細胞膜結合，可改變膜蛋白的組成，干擾膜骨架蛋白與膜的聯結，導致變形能力下降； 誘發膜脂質過氧化反應，導致連接膜骨架的膜蛋白發生氧化損傷，從而造成紅細胞膜機械穩定性下降等。研究發現，冬季(11 月份) 地中海貧血患者紅細胞膜骨架蛋白SPTA1 mRNA 的表達水平顯著高于夏季( 7 月份) ，SPTA1、SPTB、EPB4.1 對維持紅細胞結構非常重要，初步推斷地中海貧血患者夏季比冬季溶血貧血嚴重的原因之一可能與兩個季節患者紅細胞膜骨架蛋白表達不同有關。SCF 是一類刺激早期造血干細胞及祖細胞增殖和定居的造血生長因子，IL -3 為造血調控因子，也為一種炎性因子。EPO 它可以促進紅細胞的生成，使血液中紅細胞的濃度保持在一個較高的水平。本研究發現冬季( 11 月份) 血清造血細胞因子SCF、EPO 水平顯著高于夏季(7 月份) ，IL -3 活性水平冬季(11 月份) 顯著低于夏季( 7 月份) ，推斷地中海貧血患者夏季比冬季溶血貧血嚴重的原因之一可能與兩個季節患者體內與造血相關細胞因子活性不同有關。

本研究進一步證實了地中海貧血患者病情嚴重程度存在季節變化的客觀規律，并從與地中海貧血患者紅細胞溶血貧血的幾個側面初步闡釋了地中海貧血患者冬夏兩季病情嚴重程度不同的生物學機制，仍需要開展進一步的臨床研究進行驗證。

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