貴州地區漢族肺癌患者單核細胞趨化蛋白-1 -2518 A/G 基因多態性的研究

金艷坤 井曉婷 羅 靖 余 紅 張 雯 張湘燕 葉賢偉

支氣管肺癌是嚴重危害人類健康的疾病，有資料顯示，肺癌無論是年發病人數還是年死亡人數，均位居全球癌癥首位［1］。肺癌是一種與環境因素、生活方式及遺傳因素有關的惡性疾病，其發生、發展與炎性介質和某些與癌發病相關的基因多態性有關，并存在一定的遺傳易感性差異和家族聚集性［2，3］。單核細胞趨化蛋白-1( monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1) 是CC 類趨化因子，是一種重要的炎性細胞因子，參與機體多種炎性反應過程，研究表明MCP-1 -2518 基因多態性可能與惡性腫瘤的易感性相關［4，5］。目前MCP-1 基因多態性與肺癌關系的相關研究少見。筆者采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態( PCR-RFLP) 技術進行基因多態性的檢測，以期發現MCP-1 -2518 基因多態性與肺癌遺傳易感性的相關性。

材料與方法

1.研究對象：選取2013 年3 ～12 月在貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科住院治療的肺癌患者90 例作為實驗組，其中男性58 例，女性32 例，患者年齡40 ～79 歲，平均年齡57.5±11.3 歲。32 例同期健康體檢者作為對照組，其中男性19例，女性13 例，年齡42 ～76 歲，平均年齡55.7 ±13.1 歲。實驗前所有受試者均簽署知情同意書。兩組受試者均排除嚴重心血管疾病、肝腎功能不全、自身免疫性疾病、急性或嚴重慢性感染性疾病等，且相互間無血緣關系。經檢驗，兩組間年齡、性別差異無統計學意義，具有可比性。

2.實驗方法：(1) 實驗標本收集 所有研究對象均于清晨空腹抽取外周靜脈血2ml( EDTA 抗凝) ，搖勻后置于-80℃冰箱保存，用于基因組DNA 的提取。( 2) MCP -1 基因多態性檢測：1) 全血基因組DNA 的提取： 使用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，提取的DNA 進行紫外分光光度檢測。2) 引物合成及PCR 擴增：根據參考文獻［6］，合成引物。上游引物：5' -TTCTCTTCTACGGGATCTGGG -3'，下游引物： 5' - GTCTCTCCTGGCTTTAGTCAT-3'。進行PCR 擴增： 第1 階段94℃3min； 第2 階段：94℃30s，55℃30s，72℃1min，循環30 次；第3 階段：72℃5min。3) PCR 產物的檢測、限制性酶切：PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用紫外線凝膠成像系統判定目的條帶。擴增產物用PvuⅡ限制性內切酶進行酶切。酶切產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用紫外線凝膠成像系統觀察酶切結果并成像。

3.統計學方法：對實驗對象進行Hardy -Weinberg 遺傳平衡檢驗，以了解所收集的標本是否具有良好的群體代表性( P＞0.05) 。使用SPSS 19.0 統計軟件對實驗數據進行統計學處理。采用χ2檢驗對不同兩組間基因型或等位基因分布頻率的差異進行比較，P ＜0.05 為差異有統計學意義。對頻率差異有統計學意義的基因型或等位基因進行比值比( odds ratio，OR) 及其95%可信區間( confidence interval，CI) 的計算，OR 表示相對風險度。

結 果

1. MCP -1 -2518A/G 基因多態性結果分析：(1) MCP-1 -2518A/G 位點PCR 擴增后瓊脂糖凝膠電泳結果： 擴增目的DNA 片段為466bp。PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠電泳證實，在400 ～500bp 之間有一條清晰的電泳帶，說明目的DNA 的PCR 擴增成功( 圖1) 。(2) MCP-1 -2518A/G 位點PCR 產物PvuⅡ酶切后瓊脂糖凝膠電泳結果： DNA 片段經限制性內切酶PvuⅡ酶切后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳觀察3 種基因型：AA 基因型僅見1 條466bp 的電泳帶，GG基因型有327bp 和139bp 兩條電泳帶，AG 基因型有466bp、327bp 和139bp 3 條電泳帶( 圖2) 。

圖1 MCP-1 -2518G/A PCR 擴增產物電泳圖

圖2 MCP-1 -2518G/A PCR 產物PvuⅡ酶切后電泳圖

2.MCP-1 -2518A/G 多態性基因型分布在實驗組與對照組的比較： 經驗證，基因型在實驗組和對照組的分布頻率符合Hardy -Weinberg 遺傳平衡，具有群體代表性。對照組中AA、AG、GG 基因型的分布頻率分別為：6.2%、46.9%、46.9%； 實驗組中分別為：26.7%、46.6%、26.7%；3 種基因型在兩組間分布頻率差異具有統計學意義( P =0.022，表1) 。經χ2檢驗及風險性分析得出，AA 基因型個體患肺癌的相對風險度高，GG 基因型個體患肺癌的相對風險度較低，攜帶A 等位基因的個體患肺癌的相對風險是攜帶G 等位基因個體的2.368 倍，A 等位基因在病例組和對照組的分布頻率差異具有統計學意義( 表2) 。

表1 實驗組和對照組MCP-1 -2518A/G 基因型頻率Hardy-Weinberg 平衡及組間比較［n( %) ］

表2 基因型和等位基因分布頻率在兩組中的比較［n( %) ］

討 論

單核細胞趨化蛋白-1( monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1) 是CC 類趨化因子，位于17 號染色體上，包含3 個外顯子和兩個內含子，是一種重要的炎性細胞因子，參與機體多種炎性反應過程。目前研究顯示MCP-1 可通過向肺癌組織內趨化單核-吞噬細胞、促進腫瘤血管生成、腫瘤免疫逃逸等途徑影響肺癌的發生、發展［7］。Rovin 等［8］研究發現在MCP-1 元的調控區-2518A/G 位點，存在A -G 堿基突變，即AA、AG、GG 3 種基因型。MCP - 1 -2518A/G 位點突變可能影響MCP -1 的表達而影響腫瘤免疫效應，最終影響腫瘤的發病。多個研究表明MCP-1 基因-2518 位點A/G 多態性在一定程度上可以影響到腫瘤的遺傳易感性，并在腫瘤的發生、發展過程中起著重要的作用［4，5］。盡管MCP-1 及其多態性與腫瘤關系密切，但由于腫瘤的類型及地域、種族、環境及飲食等方面的差異均可能導致研究結果的不同，且目前MCP-1 基因多態性與肺癌關系的相關研究少見。

目前認為肺癌的發生與炎性反應關系密切。炎癥部位的細胞、分子或基因的改變對肺癌的發生、進展起著重要作用。慢性或持續性炎癥可誘導炎性細胞大量聚集，產生多種炎性細胞和趨化因子并引起級聯反應，誘導正常細胞DNA 氧化損害，激活癌基因，導致腫瘤發生。近年來研究證實腫瘤微環境的產生對腫瘤發生有關鍵作用。炎性反應引起腫瘤微環境募集大量巨噬細胞，中性粒細胞清除延遲、活性氧物質增加，引起腫瘤發生，微環境中的生長因子和血管生成因子使腫瘤部位的血管生成，促進腫瘤細胞增殖和轉移。肺內微環境改變可激活肺癌發生的相關信號通路、導致慢性炎癥發生。慢性持續性感染可以引起支氣管-肺泡干細胞增殖，致肺上皮細胞癌變，還能使基因組不穩定，引起DNA 損傷、癌基因激活或抑癌基因失活［9，10］。

基因多態性可導致人類患各種疾病的易感性不同，人類MCP-1 -2518A/G 基因多態性存在種族差異性。曾有報道，墨西哥人和亞洲人群攜帶G 等位基因者較高加索人和非洲人群多［11］。中國臺灣地區人群MCP-1 -2518 的G 等位基因頻率為52.4%，與已證實的亞洲人群(47%) 和墨西哥人群(47%) 相似，而高加索人群的G 等位基因頻率為29%，而非裔美國人的G 等位基因更低，只有22%［12］。土耳其人A 和G 等位基因的頻率分別為71%和29%、高加索人 為 73% 和 27%、韓 國 人 分 別 為 39.8% 和60.2%［13～15］。

本研究將90 例肺癌患者和32 例健康對照的MCP-1 -2518A/G 基因位點基因型進行檢測，結果顯示在貴州地區漢族人群中存在MCP-1 -2518A/G基因多態性，健康人群的AA、GG、AG 基因型的分布頻率與上述亞洲人群基因分布頻率相似［10，12］；MCP-1 -2518A/G 3 種基因型在實驗組和對照組中頻率分布差異具有統計學意義：在實驗組中AA 基因型的頻率明顯較對照組高，GG 基因型頻率明顯較低，AA 基因型個體患肺癌的相對風險度高，GG 基因型個體患肺癌的相對風險度較低；A 等位基因在實驗組和對照組的分布頻率差異有統計學意義( P ＜0.05) ，即攜帶A 等位基因的個體患肺癌的相對風險是攜帶G 等位基因個體的2.368 倍，提示MCP -1 -2518A/G 中A 等位基因可能是貴州地區漢族人群患肺癌的遺傳易感基因。

1 葛均波，徐永健，等. 內科學［M］.8 版. 北京： 人民衛生出版社，2013：75

2 郝罡，王文靜，陸曄，等.TNF-α、IL-1β 和IL-10 啟動子區基因多態性與肺發病易感性的關系研究［J］.環境與職業醫學，2009，1(26) ：24 -27

3 周舫，李偉輝，任文杰，等.腫瘤壞死因子TNF-β +252 基因多態性與肺癌遺傳易感性［J］. 現在預防醫學，2011，38( 7) ： 1328 -1335

4 Vázquez-Lavista LG，Lima G，Gabilondo F，et al.Genetic association of monocyte chemoattractant protein 1 ( MCP -1) -2518 polymorphism in Mexican patients with transitional cell carcinoma of the bladder［J］.Urology，2009，74(2) ：414 -418

5 Ghilardi G，Biondi ML，La TA，et al. Breast cancer progression and hostpolymorph-isms in the chemokine system：role of the macrophage chemoattractant protein - 1( MCP - 1) - 2518 G allele［J］. Clin Chem，2005，51：452

6 楊磊，時廣利，宋長興，等. 中國北方地區漢族人群MCP -1 基因多態性與肺癌相關性研究［J］. 中華微生物學和免疫學雜志，2010，30(4) ：336 -339

7 王威，周未花，葉軍輝，等.肺癌和結核性胸腔積液/血清MCP -1及其受體CCR2 的測定及臨床意義［J］. 中國高等醫學教育，2012，2：142 -143

8 Rovin BH，Saxena R，Lu L，et al. A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP - 1 expression［J］. Biochemical And Biophysical Research Communications，1999，259(2) ：344 -348

9 Houghton AM，Mouded M，Shapiro SD.Common origins of lung cancer and COPD［J］.Nat Med，2008，14(10) ：1023 -1024

10 劉晶，王朝霞.慢性炎癥與肺癌發病關系的研究進展［J］. 中華結核和呼吸雜志，2013，36(8) ：603 -605

11 馬芙蓉，倪安民，任建功，等.單核細胞趨化蛋白1 基因多態性與2型糖尿病的相關性研究［J］.臨床薈萃，2007，22(6) ：396 -399

12 Liu SF，Wang CC，Fang WF，et al. MCP1 -2518 Polymorphism and chronic obstructive pulmonary disease in Taiwanese men［J］. Experimental Lung Research，2010，36(5) ：277 -283

13 Ozyurek AR，Gurses D，Ulger Z，et al.Allelic frequency of the MCP-1 promoter - 2518 polymorphism in the Turkish population and in Turkish patients with juvenile rheumatoid arthritis［J］. Clin Rhewmatol，2007，26(4) ：546 -550

14 Zietz B，Buchler C，Herfarth H，et al. Caucasian patients with type 2 diabetes mellitus have elevated levels of monocyte chemoattractant protein-1 that are influenced by the-2518A/G promoter polymorphism［J］.Diabetes Obes Metab，2005，7(5) ：570 -578

15 Hong SB，Jin SY，Park HJ，et al. Analysis of the monocyte chemoattractant protein 1 -2518 promoter polymorphism in Korean patients with alopecia areata［J］.J Korean Med Sci，2006，21(1) ：90 -94