KD 患兒血清對細胞活力及NF-κB 表達的影響和PDTC 的干預

薛超超 李 豐 仇慧仙 陳 其 張園海

川崎病( Kawasaki disease，KD) 是一種以全身中小血管炎為主要病變的兒童急性發熱出疹性疾病，主要并發癥是冠狀動脈損害，可表現為冠脈擴張或者冠脈瘤［1］。近年來越來越引起兒科醫師重視。遺憾的是至今未能建立公認穩定的KD 動物模型，研究多基于臨床或體外細胞實驗。雖然發病機制仍不完全清楚，但必然存在免疫系統的異常激活與炎性反應的過度擴大［2］。核因子-κB( NF -κB) 是一種具有基因轉錄功能的多項調控轉錄因子，在體內炎性反應過程中起到核心作用，能促發下游炎性連鎖反應，所有炎癥相關性疾病中幾乎均能發現該通路的異常激活［3～6］。那么與冠脈病變密切相關的血管內皮細胞，其細胞內的NF -κB 信號通路能否在KD 患兒血清刺激下是否被過度激活，進而過度分泌各種細胞因子和炎性因子，造成細胞自身損害呢? 如果給予NF -κB 信號通路的抑制劑對該通路進行阻斷，能否減輕血管內皮細胞的自身損害? 為證實這些猜想，筆者做了相關實驗研究，現報道如下。

資料與方法

1.研究對象：2012 年7 月～2013 年6 月溫州醫科大學附屬育英兒童醫院兒童心血管科住院治療的KD 急性期患兒30例，KD 診斷標準符合2004 年美國兒科學會和心臟病學會制定的KD 診斷標準［1］。病程均在1 周以內，未經過IVIG 治療，排除其他免疫缺陷或者其他基礎疾病。其中男性18 例，女性12 例，患兒年齡3 個月～4 歲，平均年齡2.3 ±1.4 歲。對照組為同期在筆者醫院兒童保健科體檢患兒30 例，其中，男性16 例，女性14 例，患兒年齡3 個月～4 歲，平均年齡2.56 ±2.22 歲，檢查證實肝腎心功能正常，無基礎心血管疾病，無感染性疾病依據。

2.標本采集： 抽取KD 患兒及對照兒童外周靜脈血2ml，EDTA-K2 抗凝，1500r/min 離心5min，收集上清液，-80℃冰箱保存。

3. 細胞培養與分組： HUVEC 在RPMI1640 培養液( 含15%胎牛血清) 中培養24h，觀察細胞已貼壁，生長良好，控制密度約1 ×106/培養瓶。隨機分成4 組( 每組設10 個平行組) ：對照組( N 組) ，KD 血清組( K 組) ，IVIG 組( G 組) ，PDTC組( P 組) ，除去舊培養液，分別予不同的培養液繼續培養( 表1) ，24h 后取出，用于下一步實驗。

表1 各組培養液及干預情況(±s)

表1 各組培養液及干預情況(±s)

分組 培養液及藥物干預對照組( N 組) RPMI1640 培養基+15%正常兒童血清KD 血清組( K 組) RPMI1640 培養基+15% KD 患兒血清IVIG 組( G 組) RPMI1640 培養基+15% KD 血清+IVIG(10g/L)PDTC 組( P 組) RPMI1640 培 養 基 + 15% KD 血 清 + PDTC(100μmol/L)

4.MTT 檢測細胞活力： 取培養瓶中的HUVEC，調整細胞濃度為1 ×105/ml，接種于96 孔板，每孔加入100μl 細胞懸液，放入培養箱孵育24h，按實驗的4 組給與不同的處理，每組設5 個平行孔，繼續培養24h。然后每孔加5mg/ml MTT 20μl，繼續培養4h，每孔加入二甲基亞砜( DMSO) 100μl，震蕩10min，使晶體完全溶解，酶聯免疫儀在波長490nm 處讀取吸光度的A 值。

5.RT-PCR 檢測NF - κB p65mRNA 的表達： 通過檢索GenBank 數據庫，利用Primer 5.0 軟件設計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列和預期PCR 產物長度見表2，用前稀釋成10pmol/μl。按RNA 抽提試劑盒( Fermentas U.S.A) 說明書進行HUVEC 中RNA 的提取，RNA 的反轉錄，然后放入25μl 普通PCR 反應體系進行PCR 反應，反應條件見表3，擴增完成后取10μl PCR 擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳(120V，25 ～30min) ，紫外線燈下照相，用GelPro31 軟件測電泳條帶的IOD 比值。

表2 引物序列和預期PCR 產物長度

表3 目的基因的PCR 反應條件

6.Western blot 法檢測HUVEC 胞核內NF -κB p65 蛋白的表達：按照碧云天核蛋白提取試劑盒說明書來提取HUVEC細胞核蛋白，BCA 法測蛋白濃度，制膠，各孔加入100μg 蛋白樣品電泳，轉膜，5%小牛血清封閉液封閉1h，加兔抗單克隆抗體NF-κB p65 65kDa 一抗(1∶500) 和兔抗單克隆抗體β-actin 45kDa(1∶1000) ，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加辣根過氧化物酶( HRP) 標記的羊抗兔二抗( 1∶5000) 室溫孵育1h，TBST 洗膜3 次，膜與化學發光檢測試劑反應5min，曝光。利用Quantity One 凝膠分析軟件測定條帶的IOD 比值。

7.統計學方法：采用SPSS 17.0 統計軟件分析，全部數據進行正態性檢驗，計數資料均值用均值±標準差(±s) 表示，多組比較采用單因素方差分析( ANOVA) ，方差齊者兩兩之間比較采用SNK-q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.MTT 法檢測各組HUVEC 的細胞活力： 各組HUVEC 細胞活力的A 值見表4，圖1。結果顯示： ①KD 血清刺激下，HUVEC 的細胞活力較對照組顯著降低( P ＜0.05) ； ②在丙種球蛋白或PDTC 的干預下，HUVEC 的細胞活力較單純KD 血清刺激組均有顯著升高，且兩種干預措施組間比較細胞活力差異無統計學意義。

表4 各組HUVEC 活力的A 值(±s)

表4 各組HUVEC 活力的A 值(±s)

與N 組相比，* P ＜0.05；與K 組相比，#P ＜0.05

組別 n A值10 0.612 ±0.036 K 組 10 0.325 ±0.054*G 組 10 0.576 ±0.047#P 組 10 0.516 ±0.032 N 組#

圖1 各組HUVEC 細胞活力的A 值比較

2. RT - PCR 檢 測 各 組HUVEC 中NF - κB p65mRNA 的 表 達： 各 組 HUVEC 的 NF - κB p65mRNA 電泳的灰度圖( 圖2) 及累計光密度相對值( IOD) ( 表5，圖3) 。結果顯示： ①KD 血清刺激下，NF- κB p65mRNA 表達較對照組顯著增加( P ＜0.05) ；②在丙種球蛋白干預下，NF -κB p65mRNA表達較單純KD 血清刺激組有下降趨勢，但差異無統計學意義； ③在PDTC 的預下，KD 血清中NF - κB p65mRNA 表達較單純KD 血清刺激組顯著降低( P ＜0.05) ，且下降幅度較丙種球蛋白干預組顯著( P ＜0.05) 。

圖2 各組NF-κB p65 的電泳灰度

表5 各組NF-κB p65mRNA 的相對IOD 值(±s)

表5 各組NF-κB p65mRNA 的相對IOD 值(±s)

與N 組比較，△P ＜0.05； 與K 組比較，◇P ＜0.05； 與G 組比較，* P ＜0.05

組別 n NF-κ B p65 mRNA N 組10 0.599 ±0.033 K 組 10 1.219 ±0.024△G 組 10 0.879 ±0.012 P 組 10 0.459 ±0.060◇＊

圖3 各組NF-κB p65mRNA 的相對IOD 值比較

3.Western blot 法檢測各組NF -κB p65 蛋白的相對表達：各組HUVEC 胞核內的NF -κB p65 蛋白電泳灰度圖( 圖4) 及相對IOD 值表達( 表6，圖5) 。結果顯示：①KD 血清刺激下，NF -κB p65 蛋白的表達較對照組顯著增加( P ＜0.05) ； ②在丙種球蛋白干預下，KD 血清中NF -κB p65 蛋白的表達較單純KD 血清刺激組有降低趨勢，但差異無統計學意義；③在PDTC 的預下，KD 血清中NF -κB p65 蛋白表達較單純KD 血清刺激組顯著降低( P ＜0.05) 。

圖4 各組HUVEC 中NF-κB p65、β-actin 蛋白的灰度

表6 各組HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相對IOD 值(±s)

表6 各組HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相對IOD 值(±s)

與N 組比較，△P ＜0.05；與K 組比較，◇P ＜0.05

組別 n NF-κB p65蛋白N 組10 0.195 ±0.068 K 組 10 0.526 ±0.128△G 組 10 0.479 ±0.072△P 組 10 0.172 ±0.135◇

圖5 各組HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相對IOD 值比較

討 論

川崎病臨床主要表現為發熱( ＞5 天) 、不規則皮疹、頸部淋巴結非化膿性腫大、眼結合膜炎、口唇皸裂、楊梅舌、掌( 跖) 紅斑、手足硬性水腫等，最嚴重的并發癥是冠狀動脈損害( CAL) ，表現為冠脈擴張或者冠脈瘤［1］，即使急性期未觀察到CAL，成人期發生缺血性心臟病的危險性仍然增加［7］。KD 的發病機制尚不完全清楚，但必然存在免疫系統的異常激活與炎性反應的過度擴大。目前國際上較為認可的假說是，某種或某類病原體感染特殊基因的敏感個體，發生免疫系統的異常激活與過度擴大的炎性反應，進而出現的一系列病理過程［2］。所以尋找KD 的炎性反應核心環節，對KD 的發病機制和針對性治療都有重要意義。

NF-κB 是一種多極基因調控的轉錄蛋白，具有廣泛的生物學活性，在靜息狀態下，NF -κB 多以異二聚體的形式與IκB 結合存在于胞質，激活后進入細胞核發揮轉錄功能，進而直接或間接調控免疫炎性反應相關的靶基因如細胞因子、趨化因子、協同刺激分子及黏附分子表達，從而出現機體一系列的炎性反應表現，故認為NF-κB 信號通路在炎性反應中起到核心 作 用［8］。本 實 驗 通 過 檢 測 細 胞 內 NF - κB p65mRNA，細胞核內NF-κB p65mRNA 蛋白的表達，能夠一定程度上反應細胞內NF -κB 信號通路的激活程度。有研究發現急性期KD 患兒外周血的單核-吞噬細胞中的NF -κB 信號通路處于異常激活狀態，并且在發生冠脈損害( CAL) 的KD 患兒中更加顯著，提示該信號通路在KD 的發生上可能起到關鍵作用［9］。但由于每個KD 患兒病程、病情輕重存在差異，患兒外周血單核-吞噬細胞數量少，故實驗結果存在一定局限性。Saito 等［10］運用轉基因技術，培育了E-DNIκB 模型小鼠，這種小鼠由于內皮細胞中IκBα 蛋白不能被降解，NF-κB 蛋白不能被釋放進入細胞核發揮作用，結果發現E-DNIκB 模型小鼠在行腹主動脈切開再縫合術后，發生腹主動脈瘤的比例較正常小鼠明顯減少，提示NF-κB 信號通路參與介導動脈壁細胞外基質的病理性重構，參與動脈瘤的形成，可能對KD 并發癥起到關鍵作用。

血管內皮細胞是炎癥早期效應靶向之一，能分泌多種炎性物質，目前國內外對血管內皮細胞的NF -κB 信號通路研究有限，故本實驗選取的人臍靜脈內皮細胞( HUVEC) 為研究細胞，實驗中筆者發現在川崎病血清的刺激下，HUVEC 細胞活力顯著下降，伴隨細胞內NF-κB p65 mRNA 表達顯著增強，細胞核內NF-κB 蛋白合成顯著增加，提示KD 患兒血清中某些物質能促使細胞內的NF-κB 信號通路過度激活，并造成細胞自身的損傷。人體中冠狀動脈內皮細胞位于血液與血管壁之間，如發生炎性介質過度分泌，不僅造成細胞自身損害，還能引起周圍的血管基膜、內彈力膜破壞，最終導致冠脈擴張和冠脈瘤等并發癥，故推測與KD 并發癥關系密切［11］。

盡管KD 發病機制尚未明確，但標準療法靜脈注射用人免疫球蛋白( IVIG)2g/kg 聯合阿司匹林口服方案的有效性已得到公認，使繼發CAL 的發生率從自然病程的20% ～25%下降至3% ～5%［12］。IVIG 可從多方面對血管內皮細胞起到保護作用，如封閉血液中單核細胞、血管內皮細胞或血小板表面受體，通過調節炎性細胞功能，抑制炎性細胞黏附，中和病原體或毒素等［13～15］。本研究中在丙種球蛋白干預下，細胞活力較單純KD 血清刺激組顯著增強，伴隨HUVEC 細胞內NF-κB p65 mRNA 表達和細胞核內NF-κB p65 蛋白表達較均有下降趨勢，但差異無統計學意義，原因可能由于IVIG 的作用是多方面的，對該通路的抑制作用效果有限，或由于樣本量較少導致的統計誤差。但徐明國等［16］的實驗結果顯示IVIG 也能起到對NF-κB 信號通路顯著抑制的作用，提示IVIG 抑制細胞NF -κB信號通路過度激活可能也是其藥理機制之一。

那么單純抑制細胞NF-κB 信號通路，是否可能對KD 的治療有效呢? 吡咯烷二硫氨基甲酸酯( PDTC) 是一種強氧化劑，能通過抑制單核細胞-吞噬細胞浸潤和抑制一氧化氮合酶( iNOS) 表達，直接或間接抑制反應性氧中間體( ROIs) 的產生等途徑抑制IκB 蛋白降解，減少NF - κB 的核移位，起到對NF-κB 信號通路特異性抑制作用［17］。本實驗中在PDTC 的干預下，HUVEC 細胞活力較單純KD 血清刺激組顯著增強，伴隨細胞內NF -κB p65 mRNA 和細胞核內NF - κB p65 蛋白的表達均顯著下降，提示PDTC 對在抑制NF -κB 信號通路的作用效果強于IVIG，并且對體外培養的內皮細胞也能起到和IVIG相近的保護作用。國外的研究還證實，PDTC 還能增強心肌梗死后心肌細胞對缺血再灌注損傷的耐受力，起到保護心肌細胞的作用。推測其有減輕冠脈擴張等并發癥的作用，故說明PDTC 在KD 的治療上有潛質的臨床價值。但是在本實驗中，筆者還發現由于PDTC 對NF-κB 信號通路強力的抑制作用，本實驗中P 組NF-κB 蛋白表達水平甚至低于正常組。有實驗研究證實，生物體內NF-κB 信號通路的作用廣泛、調控精細，在炎性反應早期，可能起到保護作用，還對內皮細胞的其他正常生理功能也起重要作用，故只有能做到對NF-κB 信號通路的精確調控，特異性的抑制性藥物才可能試用于臨床［18］。

綜上所述，本研究證明HUVEC 在KD 血清刺激下，細胞中NF-κB 信號通路被激活，造成細胞自身損害，推測與KD 的發生、發展密切相關。比較IVIG和PDTC 在體外HUVEC 的干預效果，證明PDTC 能通過抑制細胞核內NF - κB 蛋白的過度合成，增強HUVEC 對抗KD 血清的刺激，起到和IVIG 相近的保護作用，在KD 的治療上有潛在的臨床價值。同時應注意到人體內NF -κB 信號通路具有十分精細和復雜的調節機制，過度抑制很可能干擾正常生理功能，如何進行適度的抑制需要開展更深入的研究。

1 Yellen ES，Gauvreau K，Takahashi M，et al. Performance of 2004 American heart association recommendations for treatment of Kawasaki disease［J］. Pediatrics，2010，125(2) ：234 -241

2 Curtis N. Kawasaki disease and toxic shock syndrome-at last the etiology is clear? ［J］. Adv Exp Med Biol，2004，549(1) ：191 -200

3 Hayden MS，Ghosh S. NF - κB in immunobiology［J］. Cell Research，2011，21(2) ：223 -244

4 張娟，徐青. 核轉錄因子-κB 與支氣管哮喘的研究進展［J］. 國際免疫學雜志，2010，3(33) ：200 -204

5 李治琴，鄭一君，陳曉微，等. IκK -α/β、IκB -αmRNA 在系統性紅斑狼瘡患者外周單個核細胞中的表達及臨床意義［J］. 臨床皮膚科雜志，2010，39(3) ：148 -150

6 劉勇剛，李志花，陳汝福，等. NF-κB 特異性抑制劑PDTC 對人肝門部膽管癌細胞增殖及SMYD3 表達的影響［J］. 中山大學學報，2011，32(1) ：22 -25

7 Fukazawa R，Ogawa S. Long - term prognosis of patients with Kawasaki disease： at risk for future atherosclerosis? ［J］. J Nippon Med Sch，2009，76(3) ：124 -133

8 Ghosh S，Kario M. Missing pieces in the NF - kappaB puzzle［J］.Cell，2002，109( Supp1) ： S81 -S96

9 鄒崢，熊國亮，段君凱，等. 急性川崎病外周血單個核細胞核因子-кB 活化的變化［J］. 實用兒科臨床雜志，2009，24( 1) ：35 -37

10 Saito T，Hasegawa Y，Ishigaki Y，et al. Importance of endothelial NF-κB signaling in vascular remodeling and aortic aneurysm formation［J］. Cardiovasc Res，2013，97(1) ：106 -114

11 Ashouri N，Takahashi M，Dorey F，et al. Risk factors for nonresponse to therapy in Kawasaki disease［J］. J Pediatr，2008，153(3) ：365 -368

12 Newburger JW，Takahashi M，Gerber MA，et al. Diagnosis，Treatment and long - term management of Kawasaki disease： a statement for health professionals from the committee on rheumatic fever，endocarditis，and Kawasaki disease，council on cardiovascular disease in the young，American Heart Association［J］. Pediatrics，2004，114(6) ：1708 -1733

13 胡靜，王大為，王鳳鳴，等. 內皮細胞型一氧化氮合成酶基因多態性與川崎病并冠狀動脈損傷易感性的相關性［J］. 實用兒科臨床雜志，2008，23(9) ：663 -664

14 Yoshimura K，Tatsumi K，Iharada A，et al. Increased nitric oxide production by neutrophils in early stage of Kawasaki disease［J］. Eur J Pediatr，2009，168(9) ：1037 -1041

15 Ichiyama T，Ueno Y，Isumi H，et al. An immunoglobulin agent( IVIG) inhibits NF-kappaB activation in cultured endothelial cells of coronary arteries in vitro［J］. Inflamm Res，2004，53( 6) ：253 -256

16 徐明國，門麗娜，祖瑩，等. 人丙種球蛋白和阿司匹林治療對川崎病兒童循環內皮祖細胞功能的影響［J］. 中國當代兒科雜志，2011，13(12) ：966 -969

17 Luengo-Blanco M，Prando C，Bustamante J，et al. Essential role of nuclear factor-kappaB for NADPH oxidase activity in normal and anhidrotic ectodermal dysplasia leukocytes［J］. Blood，2008，112( 4) ：1453 -1460

18 Hamid T，Gu Y，Ortines RV，et al. Divergent tumor necrosis factor receptor-related remodeling responses in heart failure： Role of nuclear factor - kappaB and inflammatory activation［J］. Circulation，2009，119(3) ：1386 -1397