心肌梗死對C57BL/6J 小鼠跑輪運動日節律的影響

周 嵐 曹濟民

在自然界中，從單個細胞到高等動植物，以及人類的所有生命活動均存在著按照一定時間順序規律運行的周期性(節律性)的生命活動現象，稱為生物節律，其中最重要的生物節律是晝夜節律。心血管系統的活動也存在明顯的晝夜節律。已知血壓、心率、心排出量等心血管活動指標均存在晝夜節律，一些致命心血管事件，如心肌梗死、心源性猝死的發生也呈現出發病的晝夜時間傾向［1～3］。心血管系統自身細胞內的分子鐘可以使其對外界的神經體液刺激產生及時恰當的反應。這種分子鐘節律振蕩的衰減會影響心血管對外界環境刺激及時有效的反應，從而影響一些心血管疾病的發生、發展。同時，在各種心血管疾病模型中也發現了晝夜節律的改變。例如，在壓力負荷增加導致的心肌肥大時會出現dbp、hlf、tef、pdk4、ucp3 基因表達節律的衰減［4］。在高鹽飲食引起的高血壓模型中，肥大心肌內鐘基因的振蕩明顯衰減［5］，而在自發性高血壓模型中卻發現鐘基因的振蕩的增強［6］。在糖尿病性心臟病中發現鐘基因的雙向節律出現明顯相移［7，8］。但心肌梗死對晝夜節律的影響目前研究較少。本研究旨在觀察C57BL/6J小鼠心肌梗死對跑輪運動晝夜節律的影響。

對象與方法

1.對象:C57BL/6J 小鼠，由中國醫學科學院動物研究中心提供。

2.方法:(1)轉輪運動實驗室及動物準備:轉輪實驗需要一間配備空調、有遮光暗室功能的專用實驗室。實驗室內除進出門外，所有窗體都完全密閉不透光，室內配備紅光燈。內置密閉、通風、完全光控，可分別容納轉輪裝置的小室。C57BL/6J 小鼠體重一般為22 ～26g。每只小鼠分別飼養在裝有轉輪(直徑11.5 cm)的塑料小籠(45cm×25cm×20cm)內。實驗初首先給予12h 光照、12h 黑暗［light (L)∶dark (D)=12∶12］光照周期至少1 周，當小鼠完全適應環境以及運動節律趨于穩定后，再改為完全黑暗(DD)的環境記錄。當動物處于DD 環境時，SCN 內鐘基因仍能產生晝夜節律振蕩，維持機體晝夜節律行為的穩定存在。在DD 環境下表現白天行為(如夜行動物小鼠的睡眠時段)的時間段稱為主觀白天(subjective day);而表現黑夜行為(如小鼠的清醒狀態和轉輪運動)的時間段稱為主觀黑夜(subjective night)。在這種環境下記錄的時間稱為CT(circadian time)時間。通常1 個晝夜周期為24h，規定CT0(也即CT24)代表白天的開始(相當于早晨6:00);CT6 代表正午時分(12:00);CT12 代表傍晚時分(18:00);CT18 代表午夜(24:00)。整個實驗過程中都供給足量的常規食物和水，定期清潔籠內糞便。(2)動物分組及心肌壞死模型建立:動物分為兩組，分別是心肌梗死組(n=5)和假手術組(n=5)。采用經腹腔橫膈膜液氮冷凍致局部心肌壞死的方法模擬小鼠心肌梗死［9］。用1%戊巴比妥鈉［0.1 毫升/(10 克·體重)］腹腔注射麻醉，無菌條件下做正中約1cm 長切口，伸入5ml 注射器套管，輕輕撥開肝左葉，暴露橫膈膜，此時可見心臟搏動。套管頭部輕壓在橫膈膜上，將液氮充分預冷的鋁棒(鋁棒由有色金屬研究院提供，長10cm，直徑0.6cm，心臟接觸面呈45°并打磨光滑)。通過套管，接觸橫膈膜波動最明顯處(心尖部)，輕輕施壓持續10s。然后關腹。假手術組只開腹，不做液氮損傷。術后每日標準飲食和飲水。術后腹腔注射青霉素25000 單位/(30 克·體重)，以預防感染。(3)小鼠轉輪運動節律監測:采用Vitalview 動物行為節律記錄儀，配備Actiview 節律數據分析軟件。這些設備購于美國Mini Mitter 公司。C57BL/6 小鼠從LD 光制轉入DD 光制1 周后，根據每只小鼠自身的晝夜時間(CT)，規定以小鼠開始運動為CT12，手術在CT6 進行，首先在紅光燈下將小鼠取出，麻醉后用紅布遮掩雙眼，打開手術燈給小鼠實施心肌梗死手術，術后在紅光燈下重新將小鼠放回籠內繼續記錄1 周。

結 果

1.HE 染色鑒定局部心肌壞死:本實驗采用經腹腔橫膈膜液氮冷凍致局部心肌壞死的方法模擬小鼠心肌梗死。手術后10 天取出心臟，在左心室的前下部可發現瘢痕形成，壁很薄，向內塌陷，顯然已經發生纖維化。HE 染色發現心肌壞死部位主要位于左心室前下壁外層心肌(圖1)，心肌壞死面積約占整個心室面積的8% ～10%。

圖1 HE 染色顯示小鼠液氮冷凍致心肌壞死(×20)

2.小鼠轉輪運動節律實時監測結果:筆者用Actiview 數據分析系統對小鼠轉輪運動節律進行了實時監測，每5min 記錄1 次數據。圖2A 為1 只小鼠心肌梗死前后跑輪運動節律的代表性原始記錄圖。正常情況下C57BL/6J 小鼠在DD 環境下表現出自身內源性節律振蕩，其內源性振蕩節律＜24h，因此表現為每天運動開始時間前移，而且每只小鼠在沒有外界干預的情況下運動周期是恒定不變的。圖2A 中的黑色實線代表記錄小鼠的恒定內源性周期。小鼠心肌梗死后，繼續記錄小鼠轉輪運動節律，發現每天運動開始時間比心肌梗死前提前，圖2A 中的虛線即代表了小鼠心肌梗死后的內源性周期。同時筆者通過Actiview 數據分析軟件對該只小鼠心肌梗死前后1周的轉輪運動周期進行了分析，發現心肌梗死前運動周期為23.82h，心肌梗死后為23.42h(圖2 中B、C)，也即該小鼠的內源性運動周期縮短了0. 4h，即24min。而假手術組的1 只代表性小鼠的轉輪運動在手術前、后未發生改變(圖2 中D、E、F)。

圖2 心肌梗死對C57BL/6J 小鼠轉輪運動節律的影響

3.小鼠轉輪運動節律統計結果:對各組所有小鼠心肌梗死前后1 周的運動周期進行統計學分析，結果顯示，在DD 環境下，心肌梗死前C57BL/6J 小鼠的轉輪運動周期為23.76 ±0.21h，心肌梗死后小鼠的轉輪運動周期為23.21 ±0.15h，心肌梗死后運動周期平均縮短0.55 ±0.19h(圖3)。運動活性下降不明顯。而假手術組小鼠的轉輪運動周期始終未發生改變，其平均周期為23.68 ±0.18h。

圖3 心肌梗死前后C57BL/6J 小鼠轉輪運動周期統計圖

討 論

生物鐘可從不同途徑影響心血管活動的晝夜節律。通過逆行性偽狂犬病毒示蹤技術證明，SCN 與心臟之間存在自主神經的多突觸聯系，說明中樞鐘可以通過直接的神經聯系調節心臟功能［10］。心血管系統自身鐘基因則對環境的周期性刺激作出提前反應，使機體準確迅速地對外界變化作出反應，例如在機體覺醒之前，交感神經活性已經增加。因此中樞鐘和外周鐘通過相互整合來共同調節心血管功能節律性變化。

人們對心血管事件的晝夜節律已做了較詳盡的研究。心肌梗死和心源性猝死在凌晨的幾小時內發生率最高。而且心血管事件發生的時辰也會影響疾病的預后，例如在夜間發生心肌梗死的患者導致心力衰竭的危險性很高，而早晨發病的患者很少發生心力衰竭。Alibhai 等［11］研究發現，心肌梗死小鼠如果同時伴隨急性的晝夜節律紊亂，則心肌重塑能力減弱，其長期的結構和功能都將受到影響。說明晝夜節律改變對心臟功能影響很大。另據報道，表現S -T 段抬高的心肌梗死患者，心肌的晝夜功能差別出現了改變，說明心臟內源性的鐘機制被破壞［12］。

當急性心血管事件發生后，除了心肌的晝夜節律遭到破壞外，該事件是否還會影響中樞SCN 的晝夜節律呢?本研究發現，在DD 環境下C57BL/6J 小鼠心肌梗死后，每天比正常情況下提前出現跑輪運動，提示提前進入覺醒狀態，經統計其轉輪運動周期平均縮短0.55 ±0.19h。一般來說，晝夜周期的改變往往是由于中樞SCN 內鐘基因的表達節律出現了重調。小鼠心肌梗死后，心率、血壓都會出現相應的改變，筆者認為這種急性心肌壞死破壞了心臟內源性的鐘機制，并通過某種途徑改變了中樞SCN 內鐘基因的振蕩節律，使SCN 內源性鐘機制發生重調。而SCN 的節律振蕩一旦發生改變，不僅會改變運動周期，還可能改變受SCN 調控的自主神經的功能活性、激素的分泌及身體其他器官的功能，同時影響疾病的預后。

Boudreau 等［13］曾報道心率的節律發生改變會影響與覺醒相伴隨的交感迷走效應，從而增加清晨覺醒時急性心血管事件的發生頻率。在筆者的實驗中，心肌梗死導致小鼠跑輪運動節律改變，由于跑輪運動節律的改變直接反應了睡眠-覺醒節律的變化，勢必會引起自主神經的晝夜活性改變，從而影響疾病的轉歸。另據報道心肌梗死會降低褪黑素的分泌，由于褪黑素的分泌存在明顯的晝夜節律性且有心臟保護作用，因此褪黑素分泌節律改變也會影響心臟疾病的發生、發展［14］。所以在后續的實驗中，筆者將從自主神經活性、褪黑素等激素分泌等多方面探討心肌梗死通過怎樣的神經體液機制調控SCN 節律，SCN 自身鐘蛋白的節律振蕩發生了怎樣的變化。從時間生物學的角度尋找心肌梗死的治療手段。靶向調整晝夜鐘節律、使之正常化可能成為未來心血管疾病的治療策略之一。

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11 Alibhai FJ，Tsimakouridze EV，Chinnappareddy N，et al. Short -term disruption of diurnal rhythms after murine myocardial infarction adversely affects long -term myocardial structure and function［J］.Circ Res，2014，114(11):1713 -1722

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13 Boudreau P，Yeh WH，Dumont GA，et al. A circadian rhythm in heart rate varia -bility contributes to the increased cardiacsympathovagal response to awake - ning in the morning［J］. Chronobiol Int，2012，29(6):757 -768

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