中國漢族人群apoB VNTR 等位基因的多態性分析及其分型標準物的克隆制備

駱曉楓 洪瑩芬 何 江 單翼龍 黎揚斯 林建勛 謝金衛 周俊宜 周俊梅

載脂蛋白B(apoB)基因位于2 號染色體的短臂(2p23)，基因總長度為43kb。該基因3'端下游具有一個可變數目串聯重復序列(VNTR)，由14 ～16bp長、富含AT 二核苷酸的重復序列串聯而成［1］。這些串聯重復序列的拷貝數目以及內部結構的變化構成了apoB VNTR 等位基因的高度多態性。根據串聯重復序列拷貝數目的不同，目前已發現有22 種等位基因，長度為400 ～1200bp［2～4］。apoB VNTR 所具有的高度多態性和高度雜合性，使其不僅可以作為遺傳性標志，用于研究人類的起源、進化和遷徙［5～7］，還在個體識別、親權鑒定等法醫學領域中有很高的應用價值［6，8］。此外，apoB VNTR 等位基因在心肌梗死、血漿LDL 水平和高膽固醇血癥等疾病的基因連鎖分析、臨床及流行病學研究上有一定的研究意義［9～12］。

筆者對廣州地區大學生漢族人群進行了apoB VNTR 等位基因的檢測，調查其分型及分布頻率，并通過測序等方法分析其基因序列的組成特點，以期獲得更全面的基因多態性信息。此外，筆者利用分子克隆技術將所獲得的apoB VNTR 等位基因制備成分型標準物(allelic ladder)。目前最常用的apoB VNTR等位基因檢測方法是將PCR 擴增與凝膠電泳聯用，通過計算PCR 產物的電泳遷移率估算相對分子質量來進行基因分型［13］。這種方法依賴于相對分子質量標準品的對照，由于apoB VNTR 各等位基因間相對分子質量的差異最小僅為30bp，而等位基因的長度范圍為400 ～1200bp，市售的分子質量標準品很難滿足檢測的需要，容易造成分型的不準確。制備出apoB VNTR 等位基因分型標準物，可以用來與未知樣品比對確定基因型，使得檢測更為精確化、標準化，實驗數據在各實驗室之間能更方便進行比對。

對象與方法

1.對象:按照知情同意的原則，采集廣州地區大學生漢族無關個體366 人的生理鹽水漱口液，全部樣品均在采集當天進行基因組DNA 的提取。

2.方法:(1)口腔黏膜上皮細胞模板DNA 提取:吸取生理鹽水漱口液10ml 置于離心管，高速冷凍離心機(SIGMA)8000r/min 離心10min 得到口腔黏膜上皮細胞，采用酚-氯仿的方法提取基因組DNA。將口腔黏膜上皮細胞重懸于0.5ml抽提緩沖液(100mmol/L Tris，50mmol/L EDTA，200mmol/L NaCl，0.5% SDS，200μg/ml 蛋白酶K，pH 8. 0)，65℃水浴30min 進行細胞裂解，然后依次使用等體積的飽和酚、酚∶氯仿(1∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)，對上述細胞裂解液分別抽提1 次去除雜質，最后用乙醇洗淀DNA 并干燥，加入適量TE緩沖液溶解，紫外吸收法測定和計算DNA 的濃度和純度。(2)引物合成:PCR 擴增引物由上海鉑尚生物技術公司合成，引物序列參照羅超權等［8］為上游引物:5' - ATGGAAACGGAGAAATTATG - 3';下游引物:5' - CCTTCTCACTTGGCAAATAC-3'。(3)PCR 擴增:使用TaKaRa 公司的premix taq PCR 試劑盒。反應體系總體積為30μl:DNA 模板約0.3 ～0.5μg，premix tap 15μl(Taq1.25U，dNTP 各0. 4mmol/L，2 ×PCR Buffer)，上下游引物各0.5μl(10μmol)，用蒸餾水補足至30μl。擴增使用HEMA3200 型PCR 擴增儀，擴增程序為兩步循環法:94℃預變性7min，94℃變性1min，60℃退火及延伸共4min，30 個循環，最后60℃保溫10min。(4)常規電泳分型:擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，80mA 恒流電泳8h 后，凝膠成像儀拍照電泳結果，并通過軟件分析其電泳遷移率估算相對分子質量來進行分型。(5)群體遺傳學分析:用直接計數法計算確定廣州地區大學生漢族群體apoB VNTR 各等位基因的分布及其基因頻率分布。(6)DNA 測序:DNA 測序由廣州華大基因公司完成。(7)擴增產物回收及鑒定:從群體樣本的擴增產物中，選出不同大小片段長度的apoB VNTR 等位基因，為防止常規電泳的錯誤分型，每種等位基因均有3 個以上來自不同個體的片段。用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京百泰克公司)回收純化各個片段。回收片段進行DNA 測序，通過測序結果來確定正確的等位基因類型。(8)PCR 產物的克隆:采用pMD-19T PCR 產物克隆試劑盒(TaKaRa 公司)，將純化并測序確定的等位基因片段插入pMD19 質粒載體的多克隆位點，重組后的質粒轉化DH5α 感受態細胞，瓊脂平板培養劃線法挑取單克隆菌落，經擴大培養后，使用質粒純化試劑盒(TaKaRa 公司)得到含apoB VNTR 各等位基因的質粒，并進行DNA 測序確定插入片段的類型并命名。(9)等位基因分型標準物的制備和再鑒定:含有正確等位基因插入片段的重組質粒經擴大培養、純化后，以其作為模板進行PCR 擴增，反應體系及條件如步驟3。凝膠回收純化各等位基因的PCR 產物，混合制備成等位基因分型標準物階梯，通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證所得標準分型物的可用性。

結 果

1.群體樣本中的等位基因種類:從366 例廣州地區漢族大學生人群樣本中總共得到16 種apoB VNTR等位基因，以核心序列重復次數命名這些等位基因為HVE28、HVE30、HVE32、HVE34、HVE36、HVE38、HVE40、HVE42、HVE44、HVE46、HVE48、HVE50、HVE52、HVE54、HVE56、HVE58。

2.等位基因分布及基因頻率分布:對366 例廣州地區漢族大學生人群樣本的調查結果顯示，apoB 基因VNTR 16 種等位基因呈正態分布，頻率最高的集中在HVE30 ～HVE38，其中又以HVE34 最為常見，頻率為49.19%，其次為HVE36，頻率為22.54%(表1)。

表1 廣州地區漢族大學生人群apoB VNTR 等位基因分布

3. apoB VNTR 等位基因的序列分析:對apoB VNTR 各等位基因的測序結果進行分析，結果表明ApoB VNTR 序列由前端72bp 和末端80bp 的保守序列以及中間的重復序列構成(圖1 為等位基因HVE28 的測序結果圖譜)。觀察到重復序列主要為兩類核心序列，與Ludwig 等［2］報道的一致，一類是ATAATTAAATATTTT，稱為X 型，另一類是ATAATTAAAATATTT，稱為Y 型。但重復序列并非全為這兩種核心序列的依次間隔排列，筆者觀察到16 種等位基因的X 型和Y 型核心序列排列次序在靠近兩端的區域存在差異。

圖1 HVE28 的測序結果圖譜

同時在測序結果中發現，某些重復序列中可發生單核苷酸取代而產生的變異體，不僅有文獻報道過的G 或C 取代T，還發現A、T 相互調換的現象，以下為發現的變異體序列:ATAATTAAAATTTTT、ATAATAAAATATTTT、ATA ATTACATATTTT、ATAATTCAATATTTT、ATAATTAAAATGTTT 和ATAATTAAAGTATTT［3］。

4.等位基因階梯的制備及應用:以分別插入16種apoB VNTR 等位基因的重組質粒為PCR 擴增的模板，對各等位基因分別進行擴增，擴增產物經純化并測定濃度后，混合制備成apoB VNTR 等位基因分型標準物階梯，長度范圍為572 ～1022bp(圖2)。與常規電泳分型方法相比較，使用等位基因分型標準物階梯更加簡單快速，無須使用煩瑣的電泳遷移率方法計算相對分子質量，可以直接在電泳圖譜中讀出樣本所屬的等位基因型(圖3)。

圖2 apoB VNTR 等位基因分型標準物電泳分型結果

圖3 使用等位基因標準物進行的apoB VNTR 分型的電泳結果

討 論

筆者調查了在廣州地區漢族大學生人群中apoB VNTR 的基因型分布，在366 例樣本中總共發現了16 種等位基因。其中以HVE34 基因型最為常見，頻率為49.19%，其次為HVE36，頻率為22.54%。這些實驗數據與國內相關文獻報道的漢族人群apoB VNTR 等位基因頻率分布的研究結果存在差異，如陳保生等［14］研究的漢族人群以HVE36 最多，頻率為27.8%，HVE34 次之，為22.2%。張樂等［15］研究的漢族人群則以HVE32 最多，頻率為38.5%，HVE34次之，為20.5%。本研究與相關文獻比對，發現頻率最高類型均不同，各優勢等位基因的頻率差異也較大，分析原因可能為:①apoB VNTR 等位基因頻率分布可能在不同地區間存在差異;②實驗方法的精確性，導致分型結果有差異。此外，本研究分析了16 種等位基因的測序結果，觀察到apoB VNTR 的X 型和Y 型核心序列存在發生單核苷酸取代而產生的變異體，不僅有文獻報道過的G 或C 取代T，還發現A、T相互調換的現象，這說明apoB VNTR 等位基因的多態性不僅體現在序列長度上，同時還可能存在堿基組成上的多態性，這需要更深入的研究來證實［3］。

筆者采用分子克隆技術在國內首先制備出包含中國漢族人群apoB VNTR16 種等位基因片段的分型標準物，使用效果良好。目前對apoB VNTR 等位基因進行分型的最好方法是測序法，可以清楚地了解到核心序列結構和串聯重復次數，但一般實驗室無力購買昂貴的測序儀，樣品送到技術服務公司測序的途徑并不便捷。因此大多數實驗室仍然采用常規電泳法，通過與標準相對分子質量標準物的對照來估算等位基因片段的序列長度。由于apoB VNTR 的核心序列僅14 ～16bp，等位基因的片段最大在1000bp 以上，目前并沒有在階梯間隔和大小范圍上有符合要求的市售標準分子質量標準物，只能使用一般的標準物來代替，容易發生偏差，難以得到準確分型。因此，建立一套精確的分型標準參照物，才有可能對apoB VNTR 分型結果作出快速而正確的判斷，并在不同實驗室之間得到可重復性的結果。目前較常用的制備等位基因分型標準參照物的方法主要有簡單PCR 擴增法和分子克隆技術制備法［16］。簡單PCR 擴增法步驟簡便，但是制備出的分型標準物穩定性差，不易長期保存。而用分子克隆技術制備出等位基因分型標準物具有突出的穩定性，可大量生產，并能建立等位基因片段重組質粒庫，保證了分型標準物的永久同一性，是簡單PCR 擴增法不可比擬的。因此，為使不同實驗室間的apoB VNTR 檢測數據得以正確比較，使用等位基因分型標準物是一種非常有效的方法。

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