重組人腸三葉因子對結腸癌HT-29 細胞移行能力的影響及其機制研究

李 騰 彭 曦

嚴重創傷、燒傷、感染等應激狀態下，由于胃腸道血液灌流障礙發生早，血供恢復慢，從而導致腸黏膜屏障功能受損，這也是引發腸源性感染、腸源性高代謝、全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能不全(MODS)的重要誘因［1］。因此，如何減輕腸道損傷，促進腸黏膜修復已經成為目前燒傷治療學關注的核心問題。腸三葉因子(intestinal trefoil factor，ITF)是近年來研究發現具有獨特結構的低分子多肽類物質，它能夠維持腸黏膜的完整性，促進腸黏膜修復，但其作用機制尚未完全清楚［2］。為此，本實驗將采用Transwell 和免疫印跡方法，觀察給予重組ITF(rhITF)后，HT -29 細胞移行能力和細胞間黏附分子β -catenin 與E-cadherin 的變化，并探討其促進細胞遷移的可能機制，為ITF 的臨床應用奠定理論基礎。

材料與方法

1.細胞系:人結腸癌細胞系HT-29 購置于中科院細胞所。

2.主要的藥物與試劑:重組表達的人腸三葉因子(rhITF)由第三軍醫大學附屬西南醫院燒傷研究所提供，1640 培養基購自美國Gibco 公司，小牛血清購自奧地利PAA 公司，8μm Transwell 小室購自美國Corning 公司，β -catenin 抗兔抗體、E-cadherin 抗鼠抗體和磷酸化β -catenin 鼠抗人單抗(Y654)購自美國Abcam 公司，HRP 標記的羊抗兔二抗和HRP 標記的羊抗小鼠二抗購自北京碧云天公司。

3.細胞培養:結腸癌HT -29 細胞培養于含10%的小牛血清、100U/ml 青霉素和100U/ml 鏈霉素的1640 培養液中。培養條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，每隔2 ～3 天傳代1 次，用0.25%的胰蛋白酶消化，取對數生長期細胞進行實驗，實驗前用倒置顯微鏡觀察，細胞形態良好，折光性強。

4.觀察指標及檢測方法:(1)Transwell 法觀察rhITF 對HT-29 細胞移行能力的影響:將細胞分為陰性對照組(1640培養液)，撤掉血清后的不同濃度組:10μg/ml rhITF 組、25μg/ml rhITF 組和50μg/ml rhITF 組。收集對數期無血清培養基稀釋的HT-29 細胞，調整細胞懸液濃度5 ×106個/毫升，取100μl 接種于Transwell 小室的上室。下室中添加600μl 各濃度組別的培養液，37℃、5%CO2條件下培養12h 后分別用甲醇固定20min，1g/L 結晶紫染色15min，清水清洗數遍后鏡下計數，每組取10 個視野，算均值。(2)Western blot 法觀察rhITF 對β-catenin、E -cadherin 和磷酸化β -catenin 的蛋白表達影響:50μg/ml 濃度的rhITF 分別在4、8、12 和24h 處理HT-29 細胞，用凱基蛋白提取試劑盒進行蛋白提取和蛋白濃度檢測。8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉移至PVDF 膜，用100ml 含5%脫脂奶粉或者5% BSA 進行封閉，β -catenin抗兔抗體(1∶300)、E-cadherin 抗鼠抗體(1∶300)和磷酸化β-catenin 鼠抗人單抗(1∶200)，4℃下孵育過夜，TBST 洗膜，HRP 標記的二抗，室溫孵育1h，ECL 化學發光顯影。

5.統計學方法:Western blot 法實驗結果使用Image -Pro Plus 分析蛋白灰度，目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD 值/相應內參IOD 值。計量資料應用SPSS 17.0 統計軟件包分析處理，采用單因素方差分析，結果以均數±標準差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.rhITF 對HT -29 細胞移行能力的影響:通過穿膜細胞數的改變檢測rhITF 對HT-29 細胞移行能力的影響。50μg/ml rhITF 組的細胞數顯著多于陰性對照組、10μg/ml rhITF 組和25μg/ml rhITF 組，差異有統計學意義(P ＜0.01)，25μg/ml rhITF 組與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P ＜0. 05)。而10μg/ml rhITF 組與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05，圖1、表1)。

圖1 穿過微孔膜的HT-29 細胞結晶紫染色結果(×200)

表1 Transwell 遷移實驗穿膜細胞數(±s，n=10)

表1 Transwell 遷移實驗穿膜細胞數(±s，n=10)

組別 穿過Transwell 小室的細胞數陰性對照組113.43 ±4.62 10μg/ml rhITF 組 128.52 ±8.71#25μg/ml rhITF 組 143.10 ±18.54* #50μg/ml rhITF 組 210.64 ±25.73＊＊

2.Western blot 法檢測β-catenin 和E-cadherin的蛋白含量表達:(1)rhITF 對β -catenin 蛋白表達影響:Western blot 法檢測顯示正常對照組、4h 組、8h組、12h 組和24h 組，電泳條帶對應的相對分子質量約為95kDa。應用Image -Pro Plus 圖像分析軟件進行灰度分析:加入rhITF 后，β-catenin 的蛋白表達呈下降趨勢，與正常對照組、4h 組、8h 組和24h 組比較，12h 組β-catenin 的蛋白表達明顯降低(P ＜0.05)(圖2)。(2)rhITF 對E -cadherin 的蛋白表達影響:Western blot 法檢測顯示正常對照組、4h 組、8h 組、12h 組和24h 組，電泳條帶對應的相對分子質量約為120kDa。應用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進行灰度分析:加入rhITF 后，E -cadherin 的蛋白表達呈下降趨勢，與正常對照組、4h 組、8h 組和24h 組比較，12h 組E-cadherin 的蛋白表達明顯降低(P ＜0.05)(圖3)。(3)rhITF 對磷酸化β -catenin(Tyr654)的蛋白表達影響:Western blot 法檢測顯示各組電泳條帶對應的相對分子質量約為86kDa。應用Image -Pro Plus 圖像分析軟件進行灰度分析:加入rhITF 后，與正常對照組、4h 組、8h 組和24h 組比較，12h 組磷酸化β-catenin(Tyr654)的蛋白表達明顯增強(P ＜0.05，圖4)。

圖2 rhITF 對β-Catenin 蛋白表達影響

討 論

燒傷后腸黏膜組織修復和重建是一個非常復雜并受多因素影響的過程，主要由細胞增殖、細胞分化和細胞移行共同協調完成，其中細胞移行屬于快速修復機制，在腸黏膜早期修復中起著關鍵作用［3］。前期研究發現，與眾多生長因子相比，ITF 對腸黏膜修復具有特異性功能。ITF 是由杯狀細胞分泌的低分子多肽類物質，含有59 個氨基酸多肽，6 個半胱氨酸殘基，以3 個鏈內二硫鍵形成獨特的“三葉草”結構，其結構的高度保守使之具備抗蛋白酶、抗酸和抗熱分解的生物學活性［4］。此外，ITF 可以與黏蛋白相互作用形成黏液凝膠層，支持固定腸黏膜，并增強腸黏膜防御損傷的能力［5］。

圖3 rhITF 對E-cadherin 蛋白表達影響

圖4 rhITF 對磷酸化β-catenin(Tyr654)蛋白表達影響

實驗結果顯示，ITF 對腸黏膜的修復作用與其促進HT-29 細胞移行有關。rhITF 能顯著增加細胞移行能力，通過改變細胞形態，增加穿越微孔的細胞數量，并呈現典型的濃度依賴效應，從而促進細胞移行。前期的研究結果也證實，在黏蛋白的協同作用下，ITF促進細胞移行的效率大幅度增加［6］。但是ITF 又是如何促進細胞移行，具體的作用機制是什么，這也是本實驗研究的核心問題。細胞尾部與相鄰細胞或基質的分離是細胞移行的限速步驟，主要受控于細胞之間的黏附連接。鈣黏蛋白(E -cadherin)作為一種跨膜糖蛋白，與細胞內的β -連環蛋白(β -catenin)構成E-cadherin/β-catenin 復合物，并交聯于胞內骨架微絲系統，從而構成細胞之間的主要黏附連接［7］。因此，β -catenin 和E -cadherin 被視為是細胞移行的主要限制因素，研究ITF 對二者之間的調控作用，對于了解ITF 促細胞移行的作用機制具有重要意義。本實驗Western blot 法檢測結果顯示，與其他時相點組比較，12h 時β -catenin 和E -cadherin 的蛋白表達均明顯下降，經灰度值分析，差異具有統計學意義。結果提示，rhITF 作用12h 時通過抑制β -catenin 和E-cadherin 的蛋白表達，從而減少E -cadherin/β -catenin 復合物，降低細胞之間的黏附，促進細胞遷移。

β -catenin 和E - cadherin 除了參與細胞間的黏附之外，還調控多條信號轉導通路，由此推測ITF可能是通過某些信號轉導通路促進細胞移行。酪氨酸激酶受體通路被認為是最重要的轉導通路之一，基本上所有的生長因子刺激細胞而產生的信號都與此通路有關［8］。生長因子受體本身具有酪氨酸激酶活性，生長因子與其受體結合后，不光使受體自身發生磷酸化，同時也使相應底物發生酪氨酸磷酸化，信號就通過受體進入到細胞內而發揮作用［9］。相關研究表明，EGF 和TGF - β1 能夠誘導β -catenin的酪氨酸磷酸化水平上調［10］。前期研究結果證實，在腸上皮細胞膜上存在與ITF 特異性結合的受體(ITFR)，ITF 很可能是通過ITFR 參與眾多的細胞轉導通路［11］。Western blot 法檢測結果顯示，在rhITF 的刺激下，磷酸化β -catenin 的表達隨著時間遞增而加強，12h 時磷酸化β -catenin 蛋白表達明顯增強。

由此可見，ITF 促進細胞遷移的機制可能是當外源性的ITF 刺激細胞后，通過與其受體ITFR 結合作用后，β-catenin 發生酪氨酸磷酸化，使E-cadherin/β-catenin 復合體從肌動蛋白絲上解離，導致E -cadherin 介導細胞間黏附功能喪失，細胞之間連接松散，從而促進細胞遷移［12］。ITF 促進細胞移行的分子機制研究尚處于起始階段，具體的信號通路及調控機制還需進一步探索。

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