表沒食子兒茶素沒食子酸酯對HPV11 早期基因E6、E7mRNA 表達的影響

孫 洋 李新宇 宋莎莎 王永芳 顧 恒

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)屬小DNA 病毒，其早期基因(E1 ～E7)編碼的早期蛋白與病毒致病性密切相關，尤其是E6、E7 基因與p53、pRb 結合，致感染細胞生物學活性發生改變，導致相關疾病發生［1］。高危型HPV(如HPV16、HPV18)可致感染細胞發生永生化改變，與腫瘤的發生相關。低危型HPV(如HPV6、HPV11)感染通常引起肛門、生殖器部位的良性增生。但也有研究發現，少數頭頸部鱗癌患者病灶中僅能檢測到HPV6 及HPV11，提示低危型HPV 感染所引起的病變亦不全為良性［2］。近年來，由低危型HPV 感染引起的尖銳濕疣發生率迅速升高，患者攜帶的病毒通過性接觸傳播，成為嚴峻的公共衛生問題。

2006 年美國食品和藥物管理局(FDA)批準茶多酚作為新的處方藥，用于局部外用治療外生殖器和肛周疣(尖銳濕疣)。這是FDA 根據1962 年藥品修正案條例首個批準上市的植物藥。茶多酚中的主要活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(-)-epigallocatechin-3 -gallate，EGCG］具有多種藥理學效應，如抗氧化、抗菌、抗病毒及抗腫瘤作用。關于這兩種化合物對于感染低危型HPV 細胞的增殖以及病毒早期基因表達的影響報道不多。

本研究利用我們前期構建的攜帶HPV11 全基因組的HaCaT 角質形成細胞(下文簡稱為HPV11.HaCaT)，探討EGCG 對HPV11.HaCaT 細胞生長增殖的影響，以及對HPV11.HaCaT 細胞中HPV11 早期基因E6、E7mRNA 表達的影響［3～5］。

材料與方法

1.材料:(1)細胞:HaCaT 細胞;HPV11. HaCaT 細胞，本實驗室在前期研究中通過環化HPV11 全長DNA 后，將環化質粒經脂質體轉染至HaCaT 角質形成細胞構建而成［4，6］。(2)受試物和試劑:EGCG(美國Sigma 公司)，溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，美國Sigma 公司)中，配制成濃度為100mmol/L 的貯存液，-20℃避光保存。實驗中，將上述貯存液用含10%新生牛血清的DMEM(美國Gibco 公司)培養基稀釋至所需濃度，各組培養基中最終DMSO 的含量為0.10% ～0.01%(v/v)。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazoly tetrazolium，MTT，美國Sigma 公司)。Trizol(美國invitrgen 公司)。Reverse Transcription System(美國Prmega 公司)。SYBR?Select Master Mix，(美國Applied Biosystems 公司)。(3)儀器:酶聯免疫檢測儀(Thermo 公司);7300 型實時熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems 公司)。

2.實驗方法:(1)細胞培養:HaCaT 細胞及HPV11.HaCaT細胞培養于含10% 新生牛血清的DMEM 培養基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。(2)實驗分組:將對數生長期的HaCaT 和HPV11. HaCaT 細胞分為實驗組(加不同濃度EGCG)、溶媒對照組(加與各濃度實驗組對應的DMSO量)、無藥對照組。(3)細胞增殖測定:將HaCaT 細胞、HPV11.HaCaT 細胞接種于96 孔板中(2 ×104個細胞/孔)培養過夜，然后分別加入設置濃度的各組藥液(200 微升/孔):實驗組終濃度分別為EGCG 10、25、50、100μmol/L;溶媒對照組分別為DMSO 含量0.01%、0.025%、0.05%、0.1%;無藥對照組加等量培養基，每組設3 個復孔。分別培養24 和48h后，加5mg/ml MTT 液20 微升/孔，繼續培養4h 后，棄培養基，加入150 微升/孔DMSO 避光震蕩混勻10min，使藍紫色沉淀充分溶解，在酶標儀下以550nm 波長測定吸光度。(4)實時熒光定量PCR:根據細胞增殖試驗的結果，選擇EGCG 100μmol/L、50μmol/L 作為實驗濃度，同時設0.1% DMSO 溶媒對照及無藥對照，藥液分別處理HPV11.HaCaT 細胞12h 和24h 后，用Trizol 提取細胞總RNA。將總RNA 反轉錄為第1鏈cDNA。利用Primer-Blast 軟件設計針對HPV11 E6、E7 的熒光定量PCR 引物(表1)并合成(生工生物工程股份有限公司)。目的基因mRNA 水平通過7300 型實時熒光定量PCR儀測定。擴增體系為10μl SYBR?Select Master Mix，1. 5μl cDNA，上下游引物各0.8μl，無核酶水6.9μl，總體系為20μl。擴增條件為:50℃2min，95℃2min，95℃15s，58℃15s，72℃1min，重復40 個循環，并添加熔解曲線以確保擴增產物的特異性。每個樣品設3 個復孔，同時設內參(β-actin)對照。結果通過△△Ct 法分析。

表1 引物設計

5.統計學方法:用SPSS 18.0 軟件進行分析，試驗重復3次，結果用方差齊性檢驗。多組間比較用單因素方差分析及LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1. EGCG 對HPV11. HaCaT 細胞增殖的影響:MTT 比色法結果顯示，EGCG 在10 ～100μmol/L 受試濃度范圍內對HaCaT 細胞及HPV11. HaCaT 細胞抑制作用相對較弱(細胞生存率為分別為52% ～95%、64% ～90%)，但顯示有時間和劑量依賴趨勢(圖1、圖2)。

圖1 EGCG 對HaCaT 細胞生長的抑制作用

圖2 EGCG 對HPV11.HaCaT 細胞生長的抑制作用

2.EGCG 對HPV11.HaCaT 細胞中HPV11 E6、E-7mRNA 表達的影響:實時熒光定量PCR 結果顯示，EGCG 在50μmol/L 和100μmol/L 濃度，均可不同程度地抑制HPV11.HaCaT 細胞中HPV11E6、E7 mRNA的表達，與溶媒對照及無藥對照比較，差異均具有統計學意義(P ＜0.05，圖3、圖4)。EGCG 作用24h 時對E6、E7 mRNA 的抑制作用均強于作用12h(P ＜0.05)，但12h 的結果中，低濃度組(50μmol/L)的E6 mRNA 表達量僅為15%，而高濃度組(100μmol/L)反而為30%，兩者差異具有統計學意義(P ＜0.05);而24h 的結果中，EGCG 兩濃度組間差異無統計學意義(P ＞0.05)。兩濃度組的EGCG 對E7 mRNA 表達的抑制作用相當(P ＞0.05)。

圖3 EGCG 對HPV11 E6 mRNA 影響

圖4 EGCG 對HPV11 E7 mRNA 影響

討 論

HPV 病毒的宿主細胞為人的皮膚和黏膜上皮細胞。根據其完整基因組的不同，目前已測得的HPV可分為100 多種亞型。不同基因型的病毒組織親嗜性和致病譜不同，低危型HPV11 易感染生殖器和咽喉部位。近年來，由低危型HPV 感染引起的尖銳濕疣發生率迅速升高，目前尖銳濕疣是我國常見的性傳播疾病之一。90%的尖銳濕疣患者皮損中均能檢測到HPV11 和HPV6 感染。一些巨大型的尖銳濕疣還有惡變的可能。

雖然2006 年FDA 已批準茶多酚用于外用治療尖銳濕疣，但在我國臨床上的應用有限。目前臨床上常用的尖銳濕疣的治療手段包括激光、冷凍等局部物理療法，和鬼臼毒素、咪喹莫特等局部外用藥物治療，以及氨基酮戊酸光動力學療法等。這些治療方法主要通過清除臨床可見的疣體以及調節局部免疫功能來發揮治療作用。但對于引起尖銳濕疣的病毒本身，并無直接殺傷作用。因此這些治療手段在不良反應發生率、治愈率和復發率等方面都存在一定問題。

茶多酚作為新的尖銳濕疣處方藥，其中的主要活性成分EGCG 具有抗氧化、抗病毒及抗腫瘤作用。但關于這兩種化合物對HPV 病毒基因影響的研究報道較少。本研究利用筆者前期構建的含HPV11 基因組HaCaT 細胞(HPV11. HaCaT)，首先觀察了EGCG 對普通HaCaT 細胞以及HPV11.HaCaT 細胞生長、增殖的影響。結果表明，EGCG 對HaCaT 和HPV11.HaCaT 細胞的生長、增殖均有一定的抑制作用。在一定濃度范圍內這種抑制作用呈濃度依賴性和時間依賴性。該結果提示，EGCG 可在一定程度上通過抑制HPV11 感染細胞的增殖而改變感染細胞的生長狀態。

HPV 病毒基因主要由上游調節區(URR)、早期基因區(E)、晚期基因區(L)組成，其中早期基因(E1 ～E7)編碼的早期蛋白與病毒致病性密切相關，尤其E6、E7 基因直接對宿主細胞作用。高危型HPV感染機體后，病毒基因組常整合于宿主細胞染色體內，病毒不再維持自身的生命周期，而是跟隨宿主細胞的DNA 復制傳至子代細胞。高危型HPV 基因組在整合過程中發生多個早期基因開放閱讀框架缺失(如E1、E2、E4、E5)，導致E6 和E7 基因表達失調，宿主細胞向惡性表型發展。而低危型HPV 感染宿主后，病毒基因組與宿主細胞染色體間不發生整合，而是以外源性DNA 方式游離于宿主細胞染色體外。高危型HPV 感染細胞中，病毒E6 蛋白與宿主細胞p53結合、E7 蛋白與pRb 結合，導致細胞發生永生化改變;同時E6、E7 蛋白亦可抑制感染細胞中STAT1 的表達，以維持病毒基因的復制［6］。低危型HPV 感染細胞中，E6 和E7 蛋白依然可以分別與p53、pRb 結合，雖然這種結合的親和力較高危型低，甚至僅為高危型結和力的1/10［7］。但E6、E7 作為HPV 病毒的早期功能基因仍然在低危型HPV 病毒的致病和免疫逃逸等方面發揮重要作用。

由于低危型HPV E6、E7 蛋白的抗體未商品化，只能初步根據E6、E7mRNA 的表達判斷其被EGCG抑制的程度。根據細胞增殖試驗的結果，筆者選擇了對HPV11. HaCaT 細胞抑制作用相對強且無毒性作用(細胞存活率＞80%)的高濃度組，觀察其對HPV11.HaCaT 細胞中HPV11 E6 和E7 基因mRNA表達的影響。結果表明，EGCG 可降低HPV11.HaCaT 細胞中HPV11 E6 和E7 基因mRNA 表達水平，其相對表達量＜50%，這提示EGCG 除了能直接抑制感染細胞的生長增殖外，還能通過抑制感染細胞中HPV11 早期基因E6、E7 的表達而抑制病毒。試驗中還發現，EGCG 作用24h 時對E6、E7 mRNA 的抑制作用強于12h(P ＜0.05)，但作用12h 后，50μmol/L EGCG 對E6 mRNA 的抑制作用反而強于100μmol/L，兩者差異具有統計學意義(P ＜0.05);而24h 的結果中，EGCG 兩濃度組間差異無統計學意義(P ＞0.05)。兩濃度組的EGCG 對E7 mRNA 表達的抑制作用相當(P ＞0.05)。推測EGCG 抑制HPV11 E6表達后可能激發了感染細胞內某些旁路途徑的反饋調節，后者又部分促進了病毒基因E6 的表達，亦有可能高濃度化合物作用使某些信號通路發生激活或其他改變，但具體的信號通路及作用機制尚需進一步研究及證實。

以上研究結果提示，EGCG 在一定作用濃度下，可通過抑制HPV11 感染細胞的生長增殖和病毒早期基因E6、E7 表達而影響抑制病毒的作用。有關EGCG 是否因為對E6 和E7 基因表達的影響而改變了宿主細胞相關信號通路的活化，進而影響感染細胞的多種生物學活性目前正在研究中。

1 Boulet G，Horvath C，Vanden Broeck D，et al. Human papillomavirus:E6 and E7 oncogens［J］. Int J Biochem Cell Biol，2007，39(11):2006 -2011

2 Syrj?nen S. The role of human papillomavirus infection in head and neck cancers［J］. Ann Oncol，2010，21(Suppl 7):vii243 -245

3 吳劍波，李新宇，鄭家潤. 人乳頭瘤病毒11 型基因組DNA 在HaCaT 株中的轉染［J］.中華皮膚科雜志，2009，42(2):85 -87

4 王永芳，李新宇，宋莎莎，等. 攜帶HPV11 型基因組細胞三維培養模型的建立及其衣殼蛋白L1 的表達［J］.中國艾滋病性病，2010，16(2):105 -108

5 Yongfang W，Xinyu L，Shasha S，et al. Development of basal - Like HaCaT keratinocytes containing the genome of human papillomavirus(HPV)type 11 for screening of anti - HPV effects［J］. J Biomol Screen，2014

6 Hong S，Mehta KP，Laimins LA. Suppression of STAT-1 expression by human papillomaviruses is necessary for differentiation - dependent genome amplification and plasmid maintenance［J］. J Virol，2011，85(18):9486 -9494

7 Oh ST，Longworth MS，Laimins LA. Roles of the E6 and E7 proteins in the life cycle of low-risk human papillomavirus type 11［J］. J Virol，2004，78(5):2620 -2626