醫療器械細胞毒性試驗方法標準化探討

賀學英，王 蕊，王會如

(北京市醫療器械檢驗所，北京101111)

醫療器械細胞毒性試驗方法標準化探討

賀學英，王 蕊，王會如

(北京市醫療器械檢驗所，北京101111)

細胞毒性是醫療器械生物相容性評價的重要項目之一。四唑鹽MTT法是經典定量細胞毒性試驗方法，該實驗研究了細胞濃度、培養時間對試驗結果的影響。結果表明應用不同試驗條件的MTT法對同一待檢物會得到不同的細胞毒性結果，因此標準化MTT試驗方法對醫療器械細胞毒性試驗評價非常重要。

MTT法細胞毒性試驗;細胞生長曲線;L929細胞系

0 前言

細胞毒性是醫療器械生物相容性評價的重要項目之一。GB/T16886.5－2005《醫療器械生物學評價—體外細胞毒性試驗(ISO 10993.5:1999，IDT)》中給出了浸提液法、直接接觸法、濾膜擴散法等方法的原則，并簡要介紹了細胞毒性可定性或定量評價，但該標準并未給出各方法的標準操作程序(SOP)。MTT法是一種經典的定量細胞毒性試驗方法，GB/T14233.2－2005給出了該方法的SOP，目前國內廣泛采用這一方法對醫療器械進行細胞毒性評價。我國尚未轉化的ISO10993－5:2009(以下稱2009版國際標準)較1999年版本發生了較大變化，新版標準具體化了細胞毒性試驗方法，在附錄c中詳細給出了MTT法細胞毒性試驗的SOP，該SOP與GB/T14233.2－2005給出方法有較大不同。不同的MTT試驗方法對同一待檢物會是否能得出一致的結果是本研究要解決的問題，這關系到能否對待檢物做出客觀科學的評價。

1 材料與方法

(1)L929細胞系(ATCC)，MEM細胞培養基，3－(4，5－二甲基噻唑－2) －2，5－二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)。

(2)取100μL濃度為1×104/mL，1.5×104/mL，2× 104/mL，5×104/mL，8×104/mL，1×105/mL，2×105/mL的L929細胞分別接種于96微孔板中，相當于每孔分別接種細胞數約1×103，1.5×103，2×103，5×103，8×103，1×104，2×104，培養4 h～120 h，每24 h以MTT摻入的方式監測細胞增殖情況并繪制生長曲線。

(3)同一被檢物分別應用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009給出的MTT試驗方法檢測其細胞毒性。

2 結果與討論

2.1 不同起始細胞密度L929細胞生長曲線測定

當接種濃度較低為1×104/mL，1.5×104/mL，2×104/mL時，L929細胞在72 h之前都處于增殖緩慢狀態;在8× 104/mL，1×105/mL兩個個濃度下，細胞在生長24 h后進入對數生長期，并在72～96 h進入平臺期;2×105/mL濃度組細胞貼壁后即進入對數生長期，48 h起即進入平臺期。如表1，不同起始接種濃度L929細胞隨培養時間生長增殖情況，以酶標儀570nm與630nm測定吸光度差值表示;圖1直觀顯示了細胞生長曲線。

表1 不同接種密度L929細胞增殖情況

細胞生長進入對數生長期之前，對生長環境的變化反應較敏感，因此為排除細胞本身生長帶來的干擾，細胞毒性試驗應選擇處于對數生長期階段給予刺激物，以真實反應待檢物對細胞生長的抑制程度，這一點在2009版國際標準中特別進行了強調。

2.2 同一被檢物細胞毒性試驗

選取一高分子材料分別應用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009給出的MTT試驗方法檢測其細胞毒性，結果如下:

(1)GB/T 14233.2－2005中8.5.6 a)方法:L929初始接種濃度為1×104/mL，生長24 h后加入待檢物浸提液，培養72 h，細胞相對增殖率為15.9%，可判為有毒性。

圖1 L929細胞在不同起始密度生長曲線

(2)ISO 10993－5:2009附錄c方法:L929初始接種濃度為1×105/mL，生長24 h后加入待檢物浸提液，培養24 h，細胞相對增殖率為94.3%，可判為無毒性。

同一待檢物以不同MTT試驗方法得到完全不同的細胞毒性結果，對需做出依據試驗結果做出合格判斷的機構來說會帶來很大困惑。

從圖1生長曲線可以看出GB/T 14233.2－2005方法要求接種細胞的初始濃度較小，細胞在生長24 h后還未進入對數生長期，對任何因素的變化都會有較敏感的反應，可能會放大待檢物微小的細胞抑制作用;而在ISO 10993－5: 2009方法中，細胞初始接種量是GB/T 14233.2－2005的10倍，24 h后細胞已進入對數生長期，可較客觀地反應待檢物對細胞生長的影響。

根據細胞生長曲線，還有一個需要特別注意的問題:“加入待檢物后，細胞還應培養多久?是不是越久越能反應出待檢物的毒性?”

2009版國際標準規定:在待檢物作用24 h后細胞讀取結果，這時候對照組細胞仍應處于對數生長期，實驗組與處于對數生長期的對照組相比較得到其真實增殖率;如果待檢物加入后培養48 h或更長時間，從圖1可以看到，這時候對照組已開始進入平臺期，進入平臺期后細胞的增殖會受到抑制并開始凋亡，而當待檢物對細胞只有抑制作用而非殺傷作用時，實驗組細胞生長達到平臺期的時間會延后，經過較長時間的培養后，實驗組細胞的增殖程度可能反而會趕上或超過對照組，當計算相對增殖率時會得到假陰性結果，也就是說有時延長培養時間反而不能反映出待檢物的細胞毒性。

綜上，MTT試驗的標準操作規程(SOP)需明確規定合理的細胞初始接種量及待檢物加入后的培養時間，不能在SOP中出現彈性的要求，如“加入待檢物后培養時間不小于24 h”，或“培養24～72 h”;當細胞相對增殖率超過100%時，要特別密切關注試驗的原始吸光值，分析結果是否合理;如應用編好的程序直接讀取細胞相對增殖率，不記錄原始吸光值度，則會產生較大風險。

3 結論

應依據所應用細胞系生長特性，選擇MTT法細胞毒性試驗條件，并應標準化，隨意改變試驗條件會得到不同的試驗結果，不利于對醫療器械細胞毒性進行客觀、科學的評價。

［1］GB/T 14233.2－2005醫用輸血、輸液、注射器具檢驗方 第2部分:生物學試驗方法［S］.

［2］ISO10993－5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity［S］.

R197.39

A

1002－2376(2015)07－0009－02

2015－05－04