Box-Behnken實驗設計法優化花生衣中總黃酮提取工藝

白 甫，朱麗紅，柳小莉，唐志書，郭東艷

(陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽712046)

花生衣為豆科植物落花生(Arachis hypogaea L.)的種皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、養血止血、散瘀消腫之功。文獻報道［1］其主要含有脂質、鞣質、甾醇、花生苷、花生衣色素、兒茶素等成分，其中主要色素成分為黃酮類化合物。文獻報道［2-3］花生衣具有止血作用、抗纖維蛋白溶解、促進骨髓制造血小板、縮短出血時間、加強毛細血管的收縮、調整凝血因子缺陷等功能。臨床試驗觀察結果［4-6］表明，花生衣湯能提高化療周期患者的血紅蛋白、提高肝硬化患者的血小板數及具有防止化療引起血小板降低的作用。近年來廣泛用于胃腸、肺、子宮等內臟出血及放化療引起的血小板減少癥等。但鮮有花生衣提取工藝研究的文獻報道［7-8］。本文擬采用Box-Behnken實驗設計法優化花生衣中總黃酮的提取工藝，以期為今后進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料 花生衣購于西安盛興中藥飲片有限責任公司，經陜西中醫學院王繼濤老師鑒定為豆科植物落花生(Arachis hypogaea L.)的種皮;蘆丁對照品(中國生物制品檢定所，批號100080-200707)，兒茶素對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號:110877-201102);甲醇、乙腈為色譜純(Fisher公司);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2695泵，Waters 2996二極管陣列檢測器;UV-1102型紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司);WJN-50多功能真空濃縮機(韓國);梅特勒GB204電子天平(萬分之一);KH-400KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司);D101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永鑫實驗儀器設備廠)。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定［9］

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加20 mL甲醇，超聲處理溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密移取樣品液1 mL，用50%甲醇定容至50 mL量瓶中。精密吸取0.5～25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總黃酮最大吸收波長的確定 分別對對照品溶液和供試品溶液在200～800 nm范圍內進行掃描，結果均在510 nm處有強吸收峰。

2.1.4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液2，3，4，5，6，7 mL，分別置 25 mL 量瓶中，各加水至 6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》附錄ⅤA)，在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程A=11.339X－0.035，r2=0.999 7，結果表明蘆丁在0.016～0.056 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 樣品中總黃酮含量測定 精密吸取供試品溶液1 mL，加水至6.0 mL，按2.1.4項下“加50%亞硝酸鈉溶液1 mL”起，至“在510 nm波長處測定吸光度”，記錄吸光度，計算總黃酮含量。

2.2 兒茶素含量測定［10］

2.2.1 兒茶素對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加入50%的甲醇溶解并定容至刻度，即得濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取花生衣樣品液1 mL，用50%甲醇定容至50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。搖勻，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱:Thermo BDS Hypersil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(10∶90);檢測波長:280 nm;流速:1 mL/min;柱溫30℃。

2.2.4 含量測定 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算兒茶素的含量。

2.3 Box-Behnken實驗設計法優選總黃酮提取工藝

2.3.1 評價指標的確定 總黃酮作為花生衣的主要成分，是其發揮藥效的物質基礎，原花青素是花生衣總黃酮的主要組成部分，而原花青素主要有兒茶素和表兒茶素的單體或多聚體組合而成，兒茶素具有防治心血管疾病、預防癌癥等多種功能。它為還原性多元酚類物質，在水溶液中易被空氣氧化，常用作抗氧化劑。右旋兒茶素還有降低毛細血管的通透性、止瀉、止血、抗病毒、殺真菌、及預防胃潰瘍等多種作用，所以將兒茶素的含量定為另一評價指標。根據各指標成分在工藝選擇中的主次地位，給予不同的加權系數，求出綜合評價指標 Y［11］。

2.3.2 各因素水平的確定 采用軟件Design-Expert 8.0.5中的Box-Behnken試驗設計原理，根據預實驗結果，選取乙醇濃度、液料比與提取時間3個因素，分別以A，B，C表示，每個自變量的低中高水平分別以－1，0，1進行編碼，總黃酮與兒茶素含量為響應值，設計三因素三水平共17個試驗點的響應面分析試驗。因素水平分析選取見表1。

表1 花生衣總黃酮提取工藝響應面因素水平編碼

2.3.3 Box-Behnken試驗設計方案 設計方案與試驗結果見表2～表3。

表2 Box-Behnken設計方案與試驗結果

表3 二次回歸方程方差分析

2.3.4 模型的建立及顯著性檢驗 用軟件分析響應面的回歸參數，建立各影響因素之間的數學模型，以綜合評分為響應值的方差分析可知，一次項 A＜0.01，各因素對響應值Y的線性關系顯著;二次項A2、B2對響應值(綜合評分)Y的曲面效應顯著。利用Design-Expert 8.0.5軟件對表3數據進行多元回歸擬合，得到響應值Y對乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)的二次多項回歸模型:Y=19.03+0.49×A+0.22×B－0.037×C－0.16×A×B+0.25×A×C－0.026×B×C－1.53×A2－0.70×B2－0.03×C2，方差分析結果見表4。根據數理統計學的相關知識分析，由表3可知，整體數學模型達到顯著水平(P＜0.01)，表明在試驗因子與響應值確定的回歸方程中，其應變量與各個自變量之間的線性關系極顯著，說明該二次方程模型比較顯著。模型的失擬項不顯著(P＞0.05)，該方程對試驗擬合較好，可以對不同條件下的總黃酮含量進行預測。此外，該模型的變異系數(CV)為1.97%，在可接受范圍內。數學模型的相關系數r2=0.943 2。綜合分析表明用此模型來分析和預測花生衣中總黃酮的提取工藝結果是比較合適的。在回歸方程模型中，對各因變量進行的方差分析結果表明:模型一次項A差異極顯著;交互項差異不顯著;各個二次項A2、B2差異極顯著，說明不能用簡單的線性關系來描述試驗因素與響應值之間的關系。從回歸方程的系數值和方差分析結果可以看出，在響應面的試驗范圍內，各個試驗因素的主效應關系為:乙醇濃度＞料液比＞提取時間。各個試驗因素對花生衣總黃酮得率影響的響應曲面及等高線見圖1～圖3。

圖1 Y=f(A，B)的等高線圖與響應面

圖2 Y=f(A，C)的等高線圖與響應面

圖3 Y=f(B，C)的等高線圖與響應面

經分析計算后可知，花生衣的最佳提取工藝參數為:乙醇濃度為39.12%，液料比為16.27倍，提取時間為31 min。但考慮到實際生產條件及方差分析結果，確定優化提取條件為:提取溶劑為40%乙醇，液料比為15倍，提取時間為30 min，并按此條件進行驗證實驗。

從多元回歸方程中，可以得到各個試驗因素對花生衣總黃酮得率影響的響應曲面及等高線圖(圖1～圖3)。由圖響應面圖可知，得到響應面圖開口向下，隨著每個試驗因素的增大，響應面對應的值相應增大，當響應值增大到極值后，隨著各因素的增大，響應值逐漸減小。該模型有穩定點，最大值就是其穩定點。

2.3.5 驗證實驗 按照響應面試驗優選出的最佳工藝條件重復3次，以驗證該提取工藝條件是否具有重現性。測定結果見表4。

結果表明，響應面試驗優選的花生衣提取工藝穩定、可行。

3 小結

有關花生衣總黃酮提取方法的選擇在預實驗中分別采用了超聲提取法和回流提取法，以總黃酮及兒茶素含量作為評價指標，結果兩種方法的兒茶素得率和總黃酮得率都相差不大，考慮到大生產的設備以及經濟條件等選擇回流提取法。

在實驗的因素水平設置中，采用單因素試驗法，對影響提取效率的浸提次數，浸提溶劑，液料比，浸提溫度，浸提時間等進行了考察，以總黃酮及兒茶素含量作為評價指標，最終確定了試驗中的因素水平數。

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