24份普通白菜遺傳多樣性的形態特征和RAPD分析

肖禾，王萌，崔麗潔，開國銀，潘靜嫻

(上海師范大學生命與環境學院植物種質資源開發協同創新中心，上海200234)

24份普通白菜遺傳多樣性的形態特征和RAPD分析

肖禾，王萌，崔麗潔，開國銀，潘靜嫻

(上海師范大學生命與環境學院植物種質資源開發協同創新中心，上海200234)

利用形態特征與RAPD分析技術，分析了國內不同地區的24份普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.)種質的遺傳多樣性.結果表明，13個形態學性狀的變異系數為12.4%～69.9%，其中葉柄變異最大，子葉變異最小.24份普通白菜材料在形態學聚類的距離5處聚為4類.利用篩選出的15條RAPD引物從24份普通白菜材料中共擴增出113條帶，其中多態性條帶83條，多態率73.4%，平均每條引物條帶7.53條、多態性條帶5.53條.RAPD數據聚類在相似系數0.77處，分為8類，與形態聚類間有重疊和細分.以形態聚類4個類別計算的Nei＇s基因多樣性指標H和Shannon信息指數I，均為第Ⅳ大類＞第Ⅰ大類＞第Ⅲ大類＞第Ⅱ大類，第Ⅳ類的H和I分別為0.2395和0.3523.而不同地區則以江淮地區的Nei＇s基因多樣性H和Shannon信息指數I最高，分別為0.2076和0.3098.這些結果與普通白菜種質資源多樣性特征以及地區分布相吻合.

普通白菜；形態特征；RAPD分析；聚類分析

普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.)為十字花科蕓薹屬蕓薹種小白菜(不結球白菜)亞種的一個主要變種［1-2］，屬異花授粉作物.授粉方式多樣，變種內、種內和種間雜交廣泛，因此，經長期選擇，就產生了復雜變異，形成了豐富的品種資源，表現為形態、習性、生態適應性上的差異類型［3-4］；此外，不同生態環境下栽培，也可形成不同的群體［5］.為此，不結球白菜分類一直存在著廣泛的爭議，也使得品種繁多的普通白菜種質資源的收集和整理存在一定難度，尤其是同種異名和同名異種的種質更加難以確定其類別和地位.因此，進行普通白菜種質資源的鑒定對種質的收集和保存意義重大.

種質鑒定方法有形態學方法和分子標記技術兩種類型［6-9］，形態學方法易受栽培技術和季節變化等影響，準確性不高；分子標記技術直接以DNA形式表現，有穩定、快速、準確的特點［9-10］，已被廣泛用于紫珠［11］、溫郁金［12］、菠蘿［13］、油茶［14］、芹菜［15］、不結球白菜［16］等不同植物的種質鑒定、遺傳多樣性分析和圖譜構建.目前在不結球白菜上進行分子標記取得了一定進展［16-18］，侯喜林［19-21］等對我國南方廣泛種植的普通白菜、塌菜等不少品種進行了親緣關系分析.宋廷宇［22］等對瀕于滅絕的薹菜進行了RAPD和SSR分析，以保護正在流失的種質資源.盡管前人已做了不少工作，但目前市場上品種混雜現象嚴重，尤其是同名異種或異種同名現象非常普遍，因此進行品種鑒定以理清品種間的親緣關系顯得十分必要.本研究結合形態學性狀和RAPD分子標記，對產自我國不同地區的不同類型的24份普通白菜種質，進行變種內親緣關系的分析，以期為普通白菜種質資源收集、保存、利用提供依據，也為已建成的普通白菜種質資源庫［23］的修訂以及正在創建的不結球白菜種質數據庫提供正確信息.

1 材料與方法

1.1 植物材料

參試的普通白菜材料共計24份(表1)，分別標記為1～24，全部為市場購買.品種選擇考慮了產地、形態特征、播期等因素，盡量在適宜播期內，品種的分布范圍盡可能代表普通白菜在國內的分布區域，形態上要將各種特征包含在內，如株型、葉色等.種子產地包括華東、華北、西北、華中、華南等地區的13個省份；株高有矮箕、中梗和高梗之分；葉色有墨綠、綠、淺綠類型；葉面有光滑、皺縮和帶毛類型.試驗分2012年和2013年2個年度進行，其中2012年為預備實驗.播種時間分別為2012年10月8日、2013年10月11日，露地穴播，穴距20 cm×15 cm，二葉一心期定植.小區面積9 m2，重復2次.正常田間管理.

表1 用于RAPD分析的普通白菜名稱及產地

1.2 試驗方法

1.2.1 形態特征調查

在正常收獲期(2013年為1月10日，2014年為1月14日)，調查24個品種的葉長、葉柄長、葉寬、葉柄寬、葉厚、葉柄厚、冠幅、株高、蓮座葉數等數量性狀和株型、葉形、葉緣、葉面、葉色、葉柄色等質量性狀.每個小區取5株代表性的植株調查，重復2次.調查標準參照［3］進行.數量性狀數據按2年平均，質量性狀取2年相同的表現.

1.2.2 RAPD分子標記操作

1.2.2 .1DNA提取

采用CTAB法提取.所用嫩葉取自2013年的田間植株，完成品種田間形態調查后，每份材料選取1～2 g嫩葉，放入冰盒中，迅速帶回實驗室，置冰箱中保存，備用.

取適量(比指甲蓋稍大)葉片放入EP管，加適量石英砂，再加300 μL PVP+CTAB的混合液，研磨到看不見組織后，又加300 μL上述混合液研磨.在通風櫥中加入6 μL巰基乙醇后，65℃水浴1 h (每隔15～20 min搖1次).水浴后，加600 μL苯酚-氯仿(1∶1)混合液，4℃12000 r/min離心20 min，分層.取上清液于EP管，輕搖，相同條件下離心.上清液移入約1 mL無水乙醇的EP管中，混勻，-20℃冰箱處理30～60 min，取出，4℃離心.倒去上清液，加600 μL 75%乙醇，4℃12000 r/min離心10 min.去掉上清液，殘液留到紙上，45～50℃烘干，10～15 min，無乙醇味道止.殘渣加40 μL無菌水溶解，再加0.8 μL的RNAse，37℃水浴30 min，獲得DNA提取液，-20℃冰箱保存.電泳和紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度.

1.2.2 .2PCR擴增

本試驗所用120條引物和生化試劑全部購自上海生物工程有限公司，引物按［18］的方法篩選，PCR體系和程序采用史公軍等［19］的方法.PCR反應體系25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.9 μL，60 ng DNA模板1 μL，不足用ddH2O補足.PCR循環程序為：94℃變性2 min，37℃復性30 s，72℃延伸50 s，2個循環；94℃變性45 s，37℃復性30 s，72℃延伸50 s，18個循環；72℃延伸5 min，94℃變性45 s，37℃復性30 s，72℃延伸50 s，25個循環；72℃延伸5 min，4℃保存.擴增結束后，取產物10 μL，加溴酚藍指示劑，混勻后上樣電泳，1xTBE電泳緩沖液，1.6%瓊脂糖凝膠，EB1 μg/ mL，在凝膠60℃左右加入.電壓100 V，時間2 h.電泳結束后，取出膠，在FR-200紫外可見圖像分析儀中觀察、拍照和記錄.

1.3 數據處理

1.3.1 形態數據

將田間采集的15項形態性狀數據分成2種，其中數量性狀計算實測值的平均值，質量性狀按［6］進行賦值處理和數量化，并用SPSS 19.0軟件對數量化的性狀進行多樣性分析和Q型聚類分析.

1.3.2 RAPD數據

統計分子量在200～3000 bp DNA的條帶，電泳圖譜上選擇清晰、穩定、重復性好的條帶記為1，相同位置缺失的記為“0”，將數據輸入計算機，形成0/1矩陣.利用軟件NTSYSpc2.1e版分析0/1矩陣，SIMQUAL程序計算相似系數，UPGMA法聚類分析，生成樹狀圖［10］.

2 結果分析

2.1 形態特征分析

24份普通白菜品種的13份數量性狀多樣性分析顯示(表2)，數量性狀的變異系數為12.4%～69.9%，性狀多樣性表現較為豐富.變異由高到低的排列為葉柄長、單株重、葉長、子葉凹槽深、葉寬、葉柄寬、株幅、腰粗、菜頭粗、蓮座葉數、子葉寬、子葉長.其中葉柄長的變異系數最大，達69.9%，說明該性狀變化較大，田間表現也支持了這一結果.性狀變異最小的為子葉長和寬，說明各子葉期品種差異最小.

圖1 24份普通白菜種質資源形態性狀的聚類分析樹狀圖

利用表2數據生成的Q型聚類分析樹狀圖(圖1)表明，在距離5處，24個品種分為4類，第一類10個品種，為5，17，9，18，6，24，1，2，21，15號，其中5，17，9，18號可歸為一小類，6，24，1，2，21，15號歸為另一小類.這類植株較矮，葉卵圓或近圓，株型開展或半直立.第二類僅7，22號2個品種.該類植株較高，葉窄細長，葉披針形，株型開展.第三類為8，23，3，4，11號5個品種，其中8，23號；3，4號；11號有屬不同小類.這類株高冠幅適中，葉長葉寬適中，半直立或直立株型.第四類為10，20，16，19，13，14，12號7個品種，其中10，20號與后5個品種歸為不同小類.這類冠幅大，葉闊長，株型開展或半塌地.從采集地區來看，不同的類別與地域關系不大.上述聚類結果與24個品種的田間長勢較為吻合.

表2 普通白菜數量性狀統計分析結果

2.2 不同類型普通白菜的RAPD分析

2.2.1 不同類型普通白菜RAPD引物擴增多態性

篩選出的15個RAPD隨機引物在24份普通白菜間共擴增出113條帶，其中多態性帶83條，多態性比率為73.4%，平均每條引物擴增出7.53條和5.53個多態性條帶.產生條帶最少的是引物S306和s1041，只有50%，最多的是引物S2001，比例為100%(表3，圖2).

表3 普通白菜RAPD引物PCR擴增多態性

圖2 引物S2001(A圖)和S041(B圖)擴增結果圖

2.2.2不同類型普通白菜的遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量種群變異和分布范圍的重要指標，通常用Nei＇s基因多樣性指標H和Shannon信息指數I來表示.按照普通白菜形態性狀聚類分成的Ⅰ～Ⅳ個普通白菜類型來計算15個引物擴增后的Nei＇s和Shannon指數，其結果表明，H和I兩個指數均呈現相同特點，都是第Ⅳ大類＞第Ⅰ大類＞第Ⅲ大類＞第Ⅱ大類(表4).這就說明普通白菜形態性狀的主要類型，即第Ⅳ大類和第Ⅰ大類包含的17個品種，其等位基因的離散程度大，某一擴增產物的存在頻率大，遺傳多樣性復雜.同時，該結果也與市場上這兩類普通白菜品種變異多，數量龐大高度吻合.

表4 不同類型普通白菜的遺傳多樣性

2.2.3 不同地區普通白菜的遺傳多樣性

普通白菜原產于中國，但在中國卻存在著明顯的地域性特點.以24份試驗品種的產地來源進行的遺傳多樣性分析表明，15個引物擴增后計算的Nei＇s和Shannon指數，江淮地區的普通白菜最大，其次為華中地區，最小為新疆(表5).這一結果與普通白菜的區域分布一致.從收集到的分布于全國各區域的313份(數據未全給出，本研究的24份是其中一部分)普通白菜種質資源來看，江淮流域(主要統計江蘇、浙江、上海和安徽四省市)占45%，華中三省占11.2%，東北0.6%，新疆占0.9%，西北也只占4.7%.因此，普通白菜的遺傳多樣性在江淮地區最高，西北東北地區最低.

表5 不同地區普通白菜的遺傳多樣性

2.2.4 不同類型普通白菜的聚類分析

由RAPD數據矩陣，經軟件分析獲得的UPMGA聚類樹狀圖(圖3)，圖3中可以看出，供試的24個普通白菜品種的遺傳相似性系數在0.69～0.89間，表明普通白菜的遺傳相似性較高.在相似系數為0.77處，24份普通白菜材料分為8個大類.第一類包括19號，第二類16號，第三類10號，第四類為13號、14號，第五類12號，第六類3號，第七類包括10個品種，分別為4、5、24、7、21、22、9、18、15、17號，而該大類在相似系數0.785處，又分成2個亞類，第一亞類為4、5和24號，第二亞類為7、21、22、9、18、15和17號.第八類1、2、11、20、6、8和23號，該大類在相似系數0.815處，分為8、23號和1、2、11、20號2個亞類，且1和2的相似性很大.顯然，與24個品種的形態性狀聚類分析結果相比，RAPD數據的聚類結果更詳細，其中一致性比較好的是形態聚類的第Ⅰ類和RAPD的第七類，2個類中有7個品種是相同的，分別是5，17、9、18、24、24、15，而形態聚類的第Ⅱ類的7、22，在RAPD聚類中聚到了第七類中.第Ⅲ類與第八類有3個是相同的，分別是8、11和23.可見形態聚類與遺傳分析聚類間有較大的一致性，但后者更為詳細和準確.

圖3 24份普通白菜RAPD數據聚類圖

3 討論

利用各種分子標記，并結合形態學特征分析來鑒定種間或變種間的親緣關系和遺傳多樣性，已在不少植物種質上得到了廣泛應用［24-26］，尤其是變種繁多的不結球白菜上［3，5-6，10］.雖然在同種或變種的不同品種間的分子鑒定不多，但也取得了一定成功，陳素娟等利用SRAP、RAPD和SSP鑒定了12個普通白菜的親緣關系，得到了遺傳距離很近的結論［27］；杜黎明等利用ISSR技術鑒定了65個白菜品種的遺傳多樣性，相似系數為0.40～0.65［28］.此外，在其他作物如小麥［29］、石榴［30］、菠蘿［13］、荸薺［31］也得到了應用.這些成果較好地支持了本研究的結論.普通白菜是不結球白菜5個變種的最大變種，品種繁多，自然變異造成的種質關系非常復雜；此外，制種單位又多，信息溝通不夠暢通，同名異種、異名同種的現象普遍存在.這些情況不僅使種子真實性受到質疑，也給種質收集和保存、種質利用和創新，以及種質資源數據庫的建設帶來困難.

本研究對24份不同地區的普通白菜種質，在形態鑒定基礎上，利用RAPD分子標記技術，研究了種質間的親緣關系，雖然樣本群體有限，但其結果顯示了形態與分子鑒定在大多數情況下，鑒定結果一致，可相互印證提高真實性；但也存在不一致性，表現為有些種質在表型性上相似，形態學方法聚為一類，但RAPD分子標記發現關系較遠，如20號與10、16和19號在形態聚類中距離較近，而在RAPD聚類中相似系數則較小，顯示出分子水平上的較大遺傳差異.而有些種質在形態學上距離較遠，分屬兩個大類，但RAPD分子標記發現遺傳背景相近，屬一類，如21、7、22號種質.可見，由于RAPD標記的是穩定的DNA，較之形態鑒定的結果更為可靠.前人研究成果也較好地支持了親緣關系鑒定可采用形態與分子鑒定相結合的手段，而分子鑒定更為準確的結論［5-6，24-26］.

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Morphological character and RAPD analysis of genetic diversity of different types of Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.) Makino var.communis Tsee et Lee.pakchoi

XIAO He，WANG Meng，CUI Lijie，KAI Guoyin，PAN Jingxian
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

The genetic diversity of 24 accessions of pakchoi(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.)from different districts of China was identified by morphological characters and RAPD analysis.The results showed that the coefficient of variation of 13 morphological characters of materials was from 12.4%to 69.9%，the most was petiole length，and the least cotyledon.24 accessions were clustered into 4 groups at the distance of 5 in morphological cluster.113 bands were detecteded by15 RAPD primers，and 83 were polymorphic.The percentage of polymorphic bands was 73.4%，and the number of average and polymorphic bands each primer were 7.53 and 5.53 respectively.In RAPD analysis，8 groups at the genetic distance of 0.77 were obtained based on RAPD data.There were the overlaps and segmentation between the results of RAPD and morphological cluster.Nei＇s diversity(H)and Shannon information index(I)based on 4 types of morphological analysis were both the order ofⅣ＞Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅱ，and H and I ofⅣwere 0.2395 and 0.3523 respectively.H and I of Jianghui area were the highest in China，being 0.2076 and 0.3098 respectively.These data were in accordance with the diversity characteristics and rejoin distribution of pakchoi germplasms.

Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.；Morphological characters；RAPD analysis；Clustering analysis

S 634.3

A

1000-5137(2015)06-0585-08

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.002

(責任編輯：顧浩然，包震宇)

2015-12-01

潘靜嫻，中國上海市徐匯區桂林路100號，上海師范大學生命與環境學院，郵編：200234，E-mail：panjingx @shnu.edu.cn