桔黃假單胞菌JD37與LaCl3聯用對菠菜生長和土壤生物活性的作用

趙磊，李頌碩，金清，卞雪坤，包星星，肖明

(上海師范大學生命與環境科學學院植物種質資源開發協同創新中心，上海200234)

桔黃假單胞菌JD37與LaCl3聯用對菠菜生長和土壤生物活性的作用

趙磊，李頌碩，金清，卞雪坤，包星星，肖明

(上海師范大學生命與環境科學學院植物種質資源開發協同創新中心，上海200234)

為了探討根際促生菌與稀土元素聯用對作物生長和土壤改良的影響，采用盆栽實驗研究了一株兼具植物促生和生物防治作用的桔黃假單胞菌JD37與常見的農用稀土元素LaCl3聯合處理對菠菜生長和土壤生物活性的效果.結果表明：聯合處理顯著促進了菠菜的生長，增強菌體在菠菜根際土壤和菠菜根內的定殖能力.同時土壤脲酶、纖維素酶、蔗糖酶與過氧化氫酶活性都有提高.聯合處理顯著提高菠菜總葉綠素含量，比單獨接種JD37或澆灌LaCl3分別提高了7.06%和3.80%.土壤細菌和放線菌數量與單獨接種JD37或澆灌LaCl3相比也有顯著上升.上述結論表明稀土元素在復合微生物肥料的生產與研制中具有較大應用潛力.

桔黃假單胞菌；LaCl3；促生；定殖；土壤生物活性

0 引言

化肥的施用是保障農業收成的一個重要手段.然而，農業生產活動中化肥的過量使用會導致土壤退化和土壤板結問題的日益嚴重［1］.究其原因在于化肥中高含量的硝態氮容易與土壤中陽離子結合形成螯合物，破壞土壤本身團粒結構.植物根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR)是一類能夠自由生活在土壤或者定殖于植物根際的有益菌類［2］，它能通過分泌鐵載體提供植物生長所需的鐵元素［3］，同時合成ACC脫氨酶調控植物乙烯水平［4］，并通過產生抗生素類物質抑制多種植物病原菌，直接或間接地促進植物生長.

桔黃假單胞菌JD37(Pseudomonas aurantiacaJD37)是本實驗室自行篩選得到的一株PGPR菌株(菌種保藏號CGMCC No.1.10967)，研究發現，它對多種植物病原菌有廣譜抗性［5］，還能促進玉米、番茄等植物的生長［6］，同時具有溶磷性和產生吩嗪-1-羧酸(PCA)、硝吡咯菌素(Prn)［7］、植物生長素IAA和鐵載體的能力［8］.因此，JD37菌株具備開發成為微生物肥料的潛力.

稀土是元素周期表中15個“鑭系”元素和與“鑭系”元素化學性質相似的鈧、釔等17個元素的總稱.稀土是一種具有生物活性的物質［9］，適當濃度的稀土可以作為一種高效微肥，對植物的生理功能、生長及作物品質等方面都具有良好的促進作用，但是，稀土微肥對土壤生態活性的影響尚不明確.如何將稀土元素作為肥料高效應用于農業生產中［10］，并對土壤生物活性產生積極作用已經成為近年來研究的熱點問題［11］.

大量研究表明，微生物肥料是一種能夠提高作物產量和改良土壤的環保型肥料［12-13］，它是由一種或多種微生物與其他營養物質復混而成，并通過微生物代謝或代謝產物改善植物生長條件促進植物生長［14］.為研究JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜生長和土壤生物活性的效果是否優于單獨接種，本實驗通過研究聯用對菠菜的生長情況與品質的影響、對土壤生物活性的作用、以及對土壤生態系統中具有代表性的微生物的組成與結構變化的效果，旨在為稀土元素聯合植物根際促生菌制備成一款復合微生物肥料提供參考數據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

桔黃假單胞菌JD37(Pseduomonas aurantiacaJD37)由上海師范大學微生物分子生物學實驗室分離、純化、保藏.

1.1.2 供試植物

菠菜種子選用園葉全能菠菜，購自上海市白玉蘭蔬菜種子有限公司.

1.1.3 培養基

KB培養基：用于JD37菌株培養.牛肉膏蛋白胨培養基.高氏1號培養基.馬丁氏培養基.所有培養基使用前進行高壓滅菌，121℃，20 min.

1.1.4 稀土

稀土為LaCl3，由上海師范大學稀土功能材料上海市重點實驗室提供.

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的活化

將保存于-80℃的JD37菌株接種于KB液體培養基中，置于搖床，28℃，200 r/min震蕩培養，活化3～4次，按1%接種量接種，取培養22 h處于對數生長期的種子液(濃度約為109cfu/mL)接入裝有50 mL KB液體培養基的250 mL三角瓶中，置于搖床，28℃，200 r/min震蕩培養24 h制備成JD37菌懸液.

1.2.2 JD37菌株在菠菜根際土壤和根內的定殖能力

挑選健康飽滿、大小均一的菠菜種子，放入0.1%高錳酸鉀溶液中浸泡20 min，表面消毒后取出，用無菌水沖洗3～4遍，置于鋪有無菌濾紙的平皿中，加入無菌水15 mL，光照培養箱28℃暗培養3 d.暗培養結束后，挑選已經發芽的健康菠菜種子，播種于裝有無菌土的花盆中，2粒/盆，6盆/組，出苗后第1天，分別澆灌10 mL/株的JD37菌懸液(107cfu/mL)、含有LaCl3(200 mg/L)的JD37菌懸液和LaCl3(200 mg/L)溶液，對照組無菌水澆灌，培養期間澆灌無菌水保持土壤濕潤.實驗重復3次.分別在出苗后第10、20和30天用以下方法檢測JD37菌株在菠菜根際土壤和根內的數量.

根際土壤：取出菠菜幼苗，抖落根表土，將0.5 g土壤樣品置于裝有4.5 mL無菌水的三角瓶中，搖勻，依次按10倍稀釋的方法稀釋成土懸液.取10-5、10-6和10-7稀釋度的土壤懸液涂布在含有氨芐霉素(50 μg/mL)和氯霉素(30 μg/mL)的KB抗性平板上，28～30℃培養，3～5 d后菌落計數.實驗重復3次.

根內：取菠菜根系，用無菌水沖去根上土壤，將根系置于0.3%次氯酸鈉溶液浸泡20 min，無菌水沖洗4～5遍.在無菌條件下，將根剪成約1 cm的根段置于裝有10 mL無菌水的研缽中研磨.取10-5、10-6和10-7稀釋度的懸液涂布在含有氨芐霉素(50 μg/mL)和氯霉素(30 μg/mL)的KB抗性平板上，28～30℃培養，3～5 d后菌落計數.實驗重復3次.

1.2.3 JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜幼苗的促生效果

菠菜種子處理(方法同1.2.2)后，播種于裝有無菌土的花盆中，2粒/盆，6盆/組.實驗重復3次.于出苗后第5天、15天澆灌JD37菌懸液(107cfu/mL)和含有LaCl3(200 mg/L)的JD37菌懸液，對照組無菌水澆灌，培養期間澆灌無菌水保持土壤濕潤.于出苗后30 d，統計菠菜的根長、苗高、鮮重、干重.實驗重復3次.

1.2.4 JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜總葉綠素含量［15-16］檢測

實驗重復3次.

1.2.5 JD37菌株與LaCl3聯用對土壤生物活性的影響

實驗分別檢測JD37菌株與LaCl3聯用后對土壤土壤脲酶、纖維素酶、蔗糖酶、過氧化氫酶［17］以及土壤微生物數量［18］的影響.實驗重復3次.

2 結果與分析

2.1 JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜的促生效果

研究JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜的促生作用是為了驗證菌體活性及實際施用效果，JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜株高、根長、鮮重和干重的作用結果見表1.單因素方差分析結果表明，聯合處理或單獨接種與澆灌清水的對照組均有顯著差異(P＜0.05).結果證實，聯合處理對菠菜的促生效果略優于單獨接種JD37或澆灌LaCl3溶液.

表1 JD37菌株與LaCl3聯用對菠菜的促生作用

2.2 JD37 菌株在菠菜根際土壤和根內的定殖

從圖1可以看出，聯合處理時JD37在土壤根際定殖數量高于單獨接種JD37菌株.菠菜生長到第10天時，聯合處理條件下JD37在根際土壤中菌體數量為4.12×107cfu/g，單獨接種JD37的菌體數量為3.33×107cfu/g；第20天時，聯合處理和單獨接種在根際土壤中定殖的數量都呈下降趨勢，聯合處理的根際土壤定殖數量為9.50×105cfu/g，大于單獨接種的7.33×105cfu/g菌體定殖數量；第30天時，聯合處理的根際JD37菌體量為5.00×104cfu/g，仍然大于單獨接種的菌數量3.67×104cfu/g.

圖1 JD37在菠菜根際土壤的定殖

從圖2結果顯示，菠菜生長的第10天，在聯合處理下從菠菜根際轉入根內的JD37菌數量約為3.34× 105cfu/g，單獨接種的菌體數量較低，為1.67×105cfu/g；第20天時，聯合處理和單獨接種的每克根組織定殖菌體數分別為3.13×104cfu/g和2.00×104cfu/ g；第30天時，聯合處理和單獨接種下根內JD37菌體數都有所下降，單獨接種的根內菌體數為5.33×103cfu/g，而聯合處理的根內菌數量仍大于單獨接種，為7.63×103cfu/g.

圖2 JD37在菠菜根際土壤的定殖

結果表明，聯合處理和單獨接種JD37都可以使JD37菌株在根際土壤和根內定殖，但是聯合處理通過延長土壤中JD37菌株的存活時間，更利于JD37菌株的生長和繁殖，使JD37菌株在根際土壤和根內的定殖能力優于單獨接種JD37，這是促進植物生長的一個有利證明.

2.3 JD37菌株與LaCl3聯用后菠菜總葉綠素含量的測定

葉綠素在光合作用中起到吸收光能、傳遞光能的作用.圖3為聯合處理對菠菜總葉綠素含量的影響.單獨接種JD37或澆灌LaCl3對總葉綠素含量有較好的維持作用，新鮮菠菜葉片中總葉綠素含量分別為2.55 mg/g和2.63 mg/g.但總葉綠素含量最高的仍然是聯合處理后，每克新鮮菠菜葉片中葉綠素含量達2.73 mg/g.

圖3 菠菜總葉綠素含量

2.4 JD37菌株與LaCl3聯用對土壤生物活性的影響

為了進一步研究JD37菌株和LaCl3聯合處理對土壤生物活性的作用，探討了聯合處理后對土壤酶活性的影響.從表2中可以看出，聯合處理對4種土壤酶活性都具有促進效果，用單因素方差分析統計數據可知，聯合處理或單獨接種與澆灌清水的對照組均有顯著差異(P＜0.05).聯合處理后土壤脲酶活性達到0.145(NH3-N/100 g)，而單獨接種JD37和澆灌LaCl3溶液后土壤脲酶活性分別為0.128(NH3-N/100 g)和0.133(NH3-N/100 g)，聯合處理對土壤脲酶活性的增加效果大于單獨接種JD37或澆灌LaCl3溶液.與對照組相比，聯合處理能分別提高約81.65%的纖維素酶活性和40.65%的蔗糖酶活性，且差異顯著.聯合處理可以提高土壤過氧化氫酶活性，聯合處理的過氧化氫酶活性為0.657(mL，0.1N，高錳酸鉀/g)；單獨澆灌LaCl3的情況下，過氧化氫酶活性為0.619(mL，0.1N，高錳酸鉀/g)，聯合處理的過氧化氫酶活性比單獨澆灌的高約1.06倍.

表2 JD37菌株與LaCl3聯用對土壤酶活性的作用

2.5 JD37菌株與LaCl3聯用對土壤微生物數量的影響

土壤微生物是土壤生態系統中的重要組成部分，它的組成與結構變化都會影響到土壤的理化性質與土壤生物活性.由圖4結果可以看出，單獨接種JD37(107cfu/mL)對土壤中真菌數量的影響最大，土壤真菌數量達到約2.20×106cfu/g，其次是澆灌LaCl3處理組，土壤真菌數量約1.63×106cfu/g.聯合處理對土壤細菌和放線菌的增加效果明顯，土壤中細菌和放線菌數量分別為1.34×107cfu/g和4.73×106cfu/g，分別是對照組的和2.08倍和1.22倍.綜合上述結果認為，與單獨接種JD37或澆灌LaCl3相比，聯合處理對土壤生物活性改良效果更好，在促進植物生長的同時對土壤起到有益的調節作用.

圖4 JD37菌株與LaCl3聯用對土壤微生物數量的影響

3 討論

微生物肥料在農作物的增產和農產品的品質改善方面都發揮著重要的積極作用.它既降低農業生產成本又能減少化肥的施用，對于環境保護也有重要意義.因此，微生物肥料在我國具有非常廣闊的發展前景［19］.

大量研究表明，稀土作為微肥已經廣泛應用與中國的農業生產中［10］.桔黃假單胞菌JD37能有效定殖在玉米、小麥根部促進植物生長，還對多種植物病原菌具有廣譜抗性作用［5，20-21］，因此具有制備成微生物肥料的潛力.本實驗將桔黃假單胞菌JD37與稀土LaCl3聯合處理，研究聯合處理對植物生長以及植物生物活性的影響，旨在為JD37菌株在實際農業生產中的應用創造有利條件.桔黃假單胞菌JD37與LaCl3聯用對菠菜的促生效果顯著大于單獨接種JD37菌株或LaCl3.定殖實驗數據顯示，聯合處理的菠菜植株在生長的30 d過程中，無論是在菠菜根際土壤還是根內的菌體定殖數量始終要高于單獨接種JD37，添加LaCl3能提供給微生物更多的營養物質，更利于JD37的生長繁殖，延長了JD37在菠菜根際土壤中的存活時間，在菠菜生長的第30天時，單獨接種JD37的菌體定殖數量僅為3.67×104cfu/g和5.33×103cfu/g，而聯合處理在根際土壤和根內的菌體定殖數量分別達到5.00×104cfu/g和7.63×103cfu/g，能夠更加有效地促進植物的生長.盆栽試驗進一步證明了聯合處理對菠菜的顯著促進作用，植物生物量都明顯大于單獨接種JD37或澆灌LaCl3.菠菜總葉綠素含量測定結果顯示，雖然接種JD37菌株或澆灌LaCl3對菠菜總葉綠素含量有促進作用，但是聯合處理后菠菜總葉綠素含量仍最高，約2.73 mg/g.

選用土壤酶活性和土壤微生物數量為土壤生物活性檢測指標發現，聯合處理對土壤脲酶、纖維素酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性都有促進作用，其中，對土壤纖維素酶的活性增加效果最顯著，與單獨接種JD37或澆灌LaCl3相比，土壤纖維素酶活性分別提高了66.08%和70.93%.土壤細菌和放線菌數量在聯合處理條件下明顯增加，第30天時聯合處理的土壤中細菌和放線菌數量分別為1.34×107cfu/g和4.73 ×106cfu/g，分別是對照組的和2.08倍和1.22倍.

土壤微生物的生存取決于植物根際的空間、養分及其良好的生態環境，不同微生物具有不同的生理功能，這些功能通常具有互補性和綜合性，也是植物生長與土壤肥力的保障［22］.JD37菌株和LaCl3能促進植物生長和抑制植物病原菌，具有開發成為微生物肥料的潛力.本實驗對JD37菌株與LaCl3聯用對植物的生長和土壤生物活性的作用進行了初步探討，關于如何利用兩者之間的協同作用，進一步研制出一款復合微生物肥料還有待深入研究.

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The effect of combination of Pseudomonas aurantiaca JD37 and LaCl3on the spinach growth and soil biological activities

ZHAO Lei，LI Songshuo，JIN Qing，BIAN Xuekun，BAO Xingxing，XIAO Ming
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

In order to explore combined effects of the rhizosphere bacteria and rare earth elements on crop growth and soil improvement，in this study，Pseudomonas aurantiacaJD37 which is a plant-growth promoting rhizobacteria and can promote the growth of plants and control the biological diseases，was combining used with LaCl3which is widely used rare earth on the spinach grouth and biological activity experiments in this study growth and soil biological activities.Results showed that combined treatment promoted the growth of spinach significantly.And the densities of JD37 strain in rhizosphere and root of combined treatment of JD37 and LaCl3were significantly higher than those shown only by JD37.Moreover，the combined treatments could increase the soil enzyme activities，and especially the soil cellulose activity was increased the most.Compared with vaccination JD37 alone or watering LaCl3solution，the combined treatment could also increase the total chlorophyll content of spinach and soil microbial quantities.The total chlorophyll content of spinach increased by 7.06%and 3.80%respectively，and the quantity of bacteria and actinomycetes ascended greatly.The conclusion showed the rare earth elements has good application potential in compound microbial fertilizer production and development.

Pseudomonas aurantiaca；LaCl3；growth promoting；colonization；soil biological activity

Q 939.96

A

1000-5137(2015)06-0606-06

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.005

(責任編輯：顧浩然，郁慧)

2015-10-01

上海市教委基礎研究重點項目(11440502300)；上海市教育委員會科研創新項目(11YZ87)

肖明，中國上海市徐匯區桂林路100號，上海師范大學生命與環境科學學院，郵編：200234，E-mail：xiaom88@shnu.edu.cn