基于熒光素汞熒光法結合光纖傳感—微順序注射—閥上實驗室測定腸灌流液中H2S

侯俊峰+關明+李新霞

摘 要 建立基于光纖傳感技術結合微順序注射-閥上實驗室熒光猝滅測定腸灌流液中H2S含量方法。本研究進行單因素考察，確定以100 μL 0.1mol/L NaOH溶液為載液，熒光素汞濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L、體積50 μL、進樣體積50 μL、流通池檢測流速25 μL/s，根據H2S猝滅熒光素汞521 nm處熒光，對樣品中H2S濃度進行測定。本方法檢測H2S的濃度范圍為5.0×10 Symbolm@@ 6～8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L，檢出限為5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L。測定腸灌流液中H2S含量為3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L，RSD=3.1%（n=3）。本方法能有效在線測定樣品中H2S含量，為實時在線測定生物樣品中的H2S含量奠定基礎。

關鍵詞 光纖傳感 硫化氫 微順序注射-閥上實驗室 熒光素汞 熒光猝滅

1 引 言

硫化氫（H2S）是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，是空氣和水源的污染物之一。近研究發現，H2S是繼NO和CO之后又一種新型信號分子，作為一種活性神經調節物質廣泛存在于動物體內，參與并調節動物體諸多的生理病理活動[1]。目前，H2S的測定方法大多局限于傳統方法，如亞甲基藍法[2]、硝酸銀比色法[3]、氣相色譜法[4]等。這些傳統的方法檢出限和靈敏度無法滿足生物樣品中極微量甚至痕量H2S測定要求。而熒光法的靈敏度更高，測定H2S數量級達到10 Symbolm@@ 6 mol/L。熒光素汞具有很強熒光，H2S中S2 Symbolm@@ 與熒光素汞結合，使熒光素汞熒光猝滅，H2S含量與熒光素汞的熒光強度具有良好的相關性。

微順序注射-閥上實驗室（MicroSIA Lab-on-valve，μSIA-LOV）是第三代流動注射分析技術[5]，在μSIA-LOV分析系統中，所有的單元操作，如樣品稀釋、試劑試樣的加入、混合以及多種連用技術的結合，使得整個實驗測定過程能夠可控、高效地進行。該系統能將試劑及樣品消耗降低至微升水平，減少了試劑的使用量，適用于長時間監測和試劑比較昂貴、樣品來源受限的分析。LOV系統不僅可以與光纖傳感結合，也可以靈活與電化學[6]、色譜[7]、化學發光[8]、固相萃取[9]、原子熒光[10]等方法聯用。

本研究將光纖傳感技術與微量順序注射-閥上實驗室（μSIA-LOV）結合，以光纖作為傳導介質，將光纖光譜儀、微順序注射分析儀八通閥和氙燈光源連接，用計算機控制，利用該系統自動介觀流控特征與光纖傳感的實時監測相連，可以實現樣品的在線監測。本研究以Na2S為供體，建立光纖傳感-微量順序注射-閥上實驗室檢測腸灌流液中H2S的分析方法，為進一步進行動物在體腸灌流H2S或H2S供體藥物的腸吸收特性研究奠定分析基礎。

2 實驗部分

2.1 實驗裝置

微量順序注射儀（美國FIAlab Instruments公司）;光纖光譜儀（QE65000-FL，CCD）、連續氙燈光源（HPX-2000）、200 μm×1 m光纖兩根均為美國Ocean optics公司產品。PB-10型pH計（德國Sartorius公司）;實驗流路所用連接管道采用PTFE管（0.75 mm，I.D.）。分別采用安裝有FIAlab for Windows和SpectraSuite 軟件的Windows XP系統臺式電腦對微量順序注射分析儀和光纖光譜儀進行控制。光纖傳感-微順序注射-閥上實驗室儀器裝置：包含一個1000 μL高精密度注射泵、一個棕色濾光8通道的多位閥模塊（LOV），在該模塊上集成了一個中心控制通道、多個工作通道及一個多功能流通池等操作單元;通過軟件調節控制中心通道一端與8位閥上聯通位置，使中心通道與工作通道準確連接，另一端與高精度注射泵相連而構成流動分析系統。一根光纖與光譜儀相連，另一根光纖與氙燈光源相連，兩根光纖探頭插入LOV流通池接口，光路垂直組成熒光測定模式。

2.2 試劑及溶液配制

熒光素汞（優級純， 美國化學服務公司）;Na2S·9H2O（分析純， 天津市福晨化學試劑廠）;其余試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

準確稱取0.0159 g熒光素汞，用0.1 mol/L NaOH定容到100 mL棕色容量瓶中，濃度為1.874×10 Symbolm@@ 4 mol/L，冷藏備用，使用時稀釋到所需濃度。準確稱取0.240 g Na2S·9H2O，用水溶解并定容到100 mL，濃度為0.01 mol/L， 4 ℃密封保存備用，使用時用水稀釋到所需濃度。

Kreb-Ringer′s（KR）營養液：準確稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g于1000 mL容量瓶中，用水定容，4 ℃保存備用。

系列濃度H2S腸灌流液的配制：將0.01 mol/L Na2S溶液用KR營養液稀釋10倍（1.0 mmol/L），再分別取稀釋液0， 0.05， 0.1， 0.15， 0.2和0.25 mL于5 mL容量瓶中，用KR營養液定容。

供試品溶液：由KR營養液配制的Na2S溶液（5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L），健康大鼠麻醉后，將KR營養液由活體空腸灌流（蠕動泵流速0.2 mL/min） 30 min，接取供試品溶液于5 mL EP管中，封口4 ℃保存，待測。

2.3 操作流程

實驗流路如圖1所示，在注射泵的驅動下，首先由多位閥的6號口吸入適量載液（0.1 mol/L NaOH），7號口以50 μL/s的速度先后從中心通道吸入50 μL熒光素汞溶液，再以50 μL/s由5號口吸入適量樣品溶液，endprint

再通過6號口以50 μL/s吸入100 μL載液。在注射泵的驅動下，被吸入儲液線圈中的載液推動試劑和樣品迅速混合，形成混合區帶，并充分反應，然后再反向以25 μL/s的流速將混合區帶從連接有光纖的多功能流通池（Flow cell）流出，通過光纖光譜儀讀取反應后溶液的熒光強度。每次測定結束后，用水以300 μL/s流速沖洗整個流路。所有實驗操作均由FIAlab軟件自動完成，上述程序操作分6步，見表1。

3 結果與討論

3.1 熒光素汞熒光光譜

由通道5吸入200 μL熒光素汞（1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L），得到光譜圖（圖2），結果表明，熒光素汞最大發射波長位于521 nm。

3.2 熒光素汞濃度的選擇及體積

考察熒光素汞濃度（1.0×10 Symbolm@@ 4 mol/L ， 1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， 1.0×10 Symbolm@@ 6 mol/L）的影響，由于LOV為封閉的管道系統，管徑很小，熒光素汞濃度過大， 會粘附在管道內，清洗使用試劑多、時間長，影響測定效率;熒光素汞濃度過低， 會影響測定靈敏度，故本實驗選擇熒光素汞的濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L。 溶液體積越大，混合程度越低，為了確保充分混合、反應完全，本實驗選擇熒光素汞溶液體積為50 μL。

3.3 載流NaOH溶液濃度及體積

根據文獻 [11]，熒光素汞在堿性條件下熒光較強增加實驗的靈敏度，本研究考察不同濃度的NaOH溶液（0.01， 0.05， 0.1， 0.2和0.5 mol/L）以及水作為載液對熒光素汞（1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L）與1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L Na2S熒光強度的影響（圖3），綜合考慮，本實驗選擇0.1 mol/L NaOH作為載液。NaOH溶液為整個體系提供堿性環境，沖洗管路并推動反應后，溶液全部流過流通池，本實驗采用100 μL的0.1 mol/L NaOH作為載液，即達到上述目的。

3.4 流通池檢測流速

0.1 mol/L NaOH溶液中熒光素汞與1.0×10 Symbolm@@ 5mol/L Na2S反應后，考察通過流通池流速分別為10， 15， 20， 25， 30， 35和40 μL/s時的信號強度。結果表明，流速過慢，會加大對供試品的稀釋效應;流速過快，信號穩定，重現性降低。在流速為25 μL/s時，檢測信號最強且穩定（圖4）。

3.5 干擾物質測定

據文獻[12]報道，含巰基氨基酸可能是內源性H2S的供體，故本實驗在最佳實驗條件下，以5%的最大允許誤差進行干擾測定，考察了L-半胱氨酸、蒜氨酸、高半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸及大蒜辣素對H2S測定造成的干擾，結果如表2所示。

3.6 性能分析

熒光素汞濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5mol/L， 0.1 mol/L NaOH溶液為載液，檢測流速為25 μL/s，檢測波長為521 nm，供試品進樣量50 μL，測定系列濃度硫化氫腸灌流液，獲得在521 nm處的熒光強度，將熒光強度與濃度進行線性回歸，在5.0×10 Symbolm@@ 6～8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L范圍內，線性方程為y= Symbolm@@ 262.13x+26182（圖5），相關系數r=0.997。

4 結 論

本實驗將微量順序注射-閥上實驗室（μSIA-LOV）系統與光纖傳感技術結合，建立了熒光素汞二元體系熒光猝滅法測定生物樣品中H2S含量的方法。H2S作為一種信號分子，本身是內源性物質，參與和調節動物體多種生理及病理活動，目前對H2S的測定方法大多采用需取樣分析，需要經過多步樣品前處理。本實驗則是在LOV模塊上以熒光測定模式進行樣品測定，簡化了操作步驟，每一步操作采用程序化控制，提高了實驗可重復性和規范性;整個系統微升級的進樣量大大降低了試劑和樣品的消耗，顯著提高分析速度。本方法與光纖傳感相連可實現生物體內H2S的在線監測。

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Fluorescein Mercury Combined with Optical Sensing Micro

Sequential Injection Lab-on-Valve for Determination of

H2S in Intestinal Perfusate

HOU Jun-Feng1， GUAN-Ming1， LI Xin-Xia*2

1（Laboratory on Pollution Monitoring and Control， College of Chemistry and Chemical Engineering，

Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）

2（College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract A fluorescence quenching method was established for the determination of H2S in intestinal perfusate by optical fiber sensing technology combined with micro sequential injection lab-on-valve （μSIA-lov）. In the experiment， 100 μL of 0.1 mol/L NaOH was used as the carrier， and 50 μL of 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L fluorescein mercury and 50 μL of sample were selected for the determination. The detection flow rate at the flowcell was 25 μL/s. According to H2S quenching fluorescence at 521 nm， the concentration of H2S in the sample was determined. The detected concentration range of H2S was 5.0×10 Symbolm@@ 6-8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， and the detection limit was 5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L. Detection result of H2S in intestinal perfusion was 3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L with 3.1% RSD （n=3）. This method can be used for the determination of H2S effectively in the samples， which lay the foundation for real-time online measurement of H2S in biological samples.

Keywords Fiber sensing; Hydrogen sulfide; Micro sequential injection lab-on-valve; Fluorescein mercury; Fluorescence quenching

（Received 29 May 2014; accepted 5 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.8126048）endprint