骨髓間充質干細胞及其在組織工程中的研究進展

【摘 要】目前，對于骨髓間充質干細胞（BMSCs）的分離、培養，應用廣泛的方法主要是全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心培養法.向骨髓液中加入紅細胞裂解液后用全骨髓貼壁培養法，把紅細胞裂解掉，提高了分離純化BMSCs的效率.BMSCs的鑒定主要通過BMSCs表面抗原，但是，到目前為止，還沒有發現BMSCs的具有特異性的表面抗原標志.骨髓間充質干細胞在組織工程中的研究越來越成為目前研究的熱點.

【文獻標識碼】A

文章編號：20956894（2015）0412804

收稿日期：20150308；

接受日期：20150325

基金項目：內蒙古醫科大學科技百萬工程（YKD2012KJBW003）

作者簡介：魯先闖.碩士在讀.研究方向：關節外科.Email：295739184 ＠qq.com

通訊作者：黃 健.Email：huangjian07316＠126.com

Bone marrow mesenchymal stem cells and research progress of them in tissue engineering

LU XianChuang 1，HUANG Jian 21Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010059，China； 2Second Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010030，China

【Abstract】At present，the widely used methods for separation and culture of BMSCs are the whole bone marrow adherent culture method and density gradient centrifugation culture method.Whole bone marrow adherent culture method，with pyrolysis liquid of red blood cells added in bone marrow liquid，could crack red blood cells and thus improve the purification efficiency of BMSCs.BMSCs are indentified mainly by their surface antigens.However，no specific surface antigen marker has been found in BMSCs so far.Bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering are becoming the hot spot of current researches.

【Keywords】bone marrow mesenchymal stem cells；tissue engineering

0　引言

關節軟骨是覆蓋在關節表面可保護關節表面的彈性組織.根據流行病學調查顯示，國內40歲以上人群中，關節軟骨面二度以上磨損大約為五分之一，而60歲以上人群中，關節軟骨面二度以上磨損可達一半以上.正常的關節在關節軟骨的保護下，使人們能夠正常走路、爬樓梯、參加體育鍛煉、爬山、彎腰蹲起等，膝關節無疼痛感.關節軟骨起到保護墊的作用.病灶的軟骨或軟骨損傷令人痛苦甚至致人殘疾，這是因為軟骨缺損的修復潛力內在不足 ［1］.如同代謝失衡一樣，關節軟骨形成的整個活動，通過肥大和凋亡開始于細胞增殖，被確定為骨性關節炎（OA）進展的一個重要的決定因素 ［2－3］.修復軟骨損傷的膝關節一直具有挑戰性，大面積軟骨損傷仍難以修復.軟骨的損傷涉及到關節軟骨和潛在的軟骨下骨，關節軟骨或透明軟骨自身修復能力有限.因而，軟骨損傷治療的目標是恢復透明軟骨和軟骨下骨的再生 ［4］.

1　研究背景

20世紀90年代，WHO曾將OA與心腦血管疾病及惡性腫瘤列為威脅中老年人健康的三大殺手.對于軟骨缺損，國內外有很多研究和探索，但目前尚未攻克這一難題.

1.1 癥狀性治療

1.1.1 關節鏡清洗和清理術 該技術可以將游離體清洗出關節腔外；同時，也可治療由于外傷引起的關節軟骨破損，例如半月板的損傷、交叉韌帶的撕裂.雖然關節鏡清洗和清理術能夠暫時緩解疼痛，但是它治標不治本，沒有解決根本問題，而且疼痛易復發.

1.1.2 脛骨高位截骨術 雖然脛骨高位截骨術能夠使患者功能得到改善、使患者的關節疼痛得到緩解，但是它沒有達到根本治療關節軟骨磨損的目的.為了分析治療效果，把培養的BMSCs注射到關節內并結合微骨折術和內側開放楔形開口的脛骨高位截骨術.把培養的BMSCs注射到關節內，較單純脛骨高位截骨術、微骨折術，有效的提高了患者內翻膝軟骨缺損的短期臨床效果和磁共振觀察軟骨組織（MOCART）的結果 ［5］.

1.1.3 人工關節置換術 人工關節置換術創傷較大，給患者帶來了巨大的痛苦和經濟負擔，而且可能出現后遺癥，例如感染，假體松動等.

1.1.4 藥物治療 止疼藥物治療，例如西樂葆、吲哚美辛栓、ADSCs等，通過Koh等 ［6－8］的三項研究，他們用高濃度的ADSCs注射到髕骨下的脂肪墊中來治療膝OA.首先，他們在25個患者中做了一個病例對照研究，每名患者都接受了注射單一的ADSCs，隨后，繼續接受富血小板血漿治療，臨床結果令人滿意.在另一項研究中，與兩組病例研究（不是對照）類似的治療過程中，對于不同來源的患者使用ADSCs.所有的臨床結果和軟骨的MRI評分都顯著提高 ［7－8］.但是止疼藥物不能從根本上改變關節軟骨的缺損，而且止疼藥物也會帶來毒副作用；延緩關節軟骨退化的藥物，例如維固力，但是它只能延緩關節軟骨退化，而不能修復關節軟骨，它只能作為中老年人的一種保健藥.

1.2 骨軟骨移植

1.2.1 自體移植 該方法供體來源有限，不能用于大范圍缺損修復，并且不能根據缺損區很好的塑型，存在缺損區無法滿意整合而造成關節退變等缺點.

1.2.2 異體移植 該方法不僅會產生排斥反應、免疫反應而且會傳播疾病.

1.3 采用源于骨髓的干細胞或者纖維母細胞治療但是修復缺損的組織不是透明軟骨而是纖維軟骨，纖維軟骨在生物學強度等功能方面均比透明軟骨差，不能達到關節軟骨功能，僅能暫時緩解癥狀，后期出現骨性關節炎的可能性很大.

1.4 誘導軟骨細胞再生

1.4.1 骨膜移植 骨膜移植不僅產生的透明軟骨量少，而且再生軟骨性能差.

1.4.2 軟骨膜移植 軟骨膜移植會出現X型膠原而II型膠原較少.

1.4.3 自體軟骨細胞移植 軟骨細胞增殖能力有限，幾次傳代培養后，軟骨細胞逐漸去分化，不能繼續增殖.

1.5 外周干細胞 Saw等 ［9］做了包括50名患者的隊列研究，但使用的是外周干細胞.其研究結果很好，組織學評分和MRI上軟骨缺損修復的結果很好，但效果還需進一步驗證.

1.6 組織工程 組織工程給軟骨缺損帶來了希望.組織工程就是利用BMSCs在生物支架的作用下，加入細胞因子，從而使BMSCs向軟骨細胞分化，來修復缺損的軟骨.

2　BMSCs分離、培養的方法

BMSCs因其可塑性粘附能力、類似成纖維細胞的外表、表達特定的表面蛋白標記物而得名，并因其多向分化的能力而被明確定義.在以前的研究中已經廣泛應用了兔子的骨髓間充質干細胞BMSCs （rBMSCs），經典的例子是20世紀80年代Frieden stein等 ［10］在研究大鼠骨髓成骨髓細胞時，首次從骨髓基質中分離、鑒定出一種非造血系成體多能干細胞，并在體外把這種細胞誘導分化為各種細胞，例如誘導分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和肌肉細胞等，并把這種細胞稱之為BMSCs.體外BMSCs的提取和增殖的結果顯示，有兩個病人較其他人BMSCs的擴增速率低，這是由于人與人之間存在個體差異性 ［11］.由于在骨髓中BMSCs含量非常少，占單個核細胞的不到十萬分之一.然而組織工程需要的種子細胞的數量很大，從哺乳動物的骨髓中分離BMSCs存在缺點，使很多有關組織工程的實驗難以進行.由于骨髓中BMSCs的量非常少，而且隨著年齡的增長，BMSCs的數量逐漸減少 ［12］；并且，生理狀態下20%為靜止期細胞 ［13］.所以，找到一種體外培養BMSCs并大量擴增的培養條件，為下一步研究BMSCs生物學特性及功能和誘導分化為軟骨細胞至關重要.因此，在體外獲得純度高、活力好、生物特性均一的BMSCs，對組織工程方面的研究及細胞的體內、外實驗研究顯得極其關鍵.骨髓中不僅含有大量的造血干細胞，還含有一定量的BMSCs.就像多能造血干細胞具備強大的造血功能一樣，BMSCs也具備向軟骨細胞分化的能力，從而修復軟骨的缺損.但是，BMSCs不像造血干細胞那樣，其在骨髓中含量并不多.目前，分離培養BMSCs常用的方法包括全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心培養法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠法等 ［14］，后兩種方法雖可獲得較為純化的BMSCs，但由于BMSCs的自身特點，因其特別脆弱，在分選過程中，機械剪切力和高能激光可造成BMSCs的損傷，對其生物學特性、功能、活性、細胞形態等都會造成很大的影響.同時這兩種分離法的實驗要求較高，所用儀器及試劑昂貴，難以廣泛應用；而前兩種方法是目前分離培養BMSCs最常用的方法，其中密度梯度離心法主要有Percoll分離液分離法和Ficoll分離液分離法，二者原理基本相同，都是將骨髓組織進行密度分離，但分離液成分及各自工作液密度不同，Ficoll分離液工作的密度為1.077 g/mL.實驗采用密度可調的Percoll分離液，離心3000 r/min，30 min后取骨髓細胞懸液中間的白膜層，所獲細胞種類較單一，降低了分離液細胞中雜質細胞的比例，從而提高了BMSCs的純度.但是，骨髓液中含有較大量的紅細胞，近幾年來，國內外有學者找到一種方法，來提高BMSCs的純度，他們向骨髓液中加入紅細胞裂解液，把紅細胞裂解掉，從而提高了分離純化BMSCs的效率，希望獲得純度較高、數量較多的BMSCs ［15］.這種方法建立在全骨髓貼壁培養法的基礎上，具備全骨髓貼壁培養法的全部優點，但是，紅細胞裂解液法能夠獲得純度較高的BMSCs，而且比全骨髓貼壁培養法和密度梯度離心法得到的BMSCs量更多，同時并不影響其生物學活性，是一種簡便、可行的BMSCs分離方法.紅細胞裂解液法是在全骨髓貼壁培養法的基礎之上優化而來，能夠較早的觀察到骨髓間充質干細胞的形態，而且紅細胞裂解液法能夠得到純度較高的BMSCs，同時能為BMSCs提供營養.用紅細胞裂解液法來分離純化BMSCs的優點如下：①用紅細胞裂解液法，骨髓液中含有各種促進BMSCs的生長因子 ［15－16］.這是因為用紅細胞裂解液處理后，紅細胞裂解液能夠裂解紅細胞及血小板，從而把它們胞漿內豐富的促BMSCs的生長因子釋放出來，這些細胞因子可促進BMSCs的成集落生長，為BMSCs提供更適宜的生長微環境，從而使BMSCs生長更快 ［17］.②用紅細胞裂解液法，可以增加BMSCs的濃度，提高BMSCs的增殖速度.由于骨髓液中其它細胞明顯減少，通過離心可以得到純度較高的含有BMSCs的骨髓液，從而明顯減少BMSCs的原代培養的時間，提高BMSCs的增殖速度.③能夠較早的促進BMSCs的貼壁.研究顯示用紅細胞裂解液法，早期BMSCs的貼壁較高.這是因為使用紅細胞裂解液法，使影響BMSCs貼壁的紅細胞及血小板數量大量減少，為BMSCs貼壁留出更多的空間，以利于BMSCs的較早貼壁［18］.

3　BMSCs的鑒定

BMSCs的鑒定包括BMSCs的形態學特征、表面標記蛋白、超微結構和多向分化能力等.通過透射電子顯微鏡分析法，逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（PCR）分析法、免疫組織化學染色法、流式細胞術、alamarBlue試驗、組織學染色和定量PCR分析法來觀察細胞、鑒定細胞.BMSCs來源于具有很強多向分化潛能的中胚層，從細胞的形態學觀察，BMSCs形態像成纖維細胞，貼壁生長為長梭型細胞，原代及傳代細胞之間的形態較均一.培養的BMSCs貼壁能力很強，其中，原代細胞出現集落生長，傳代細胞培養時，可以表現出較強的增殖性能.BMSCs的表面抗原標志，具有非專一性的特征，它表達了間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面抗原標志.它的表面抗原SB10、SH2、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD120a和CD124等均呈陽性反應，且陽性率不一；而對CD14、CD34、CD45等表面抗原均呈陰性反應.但是，到目前為止，還沒有發現BMSCs的具有特異性的表面抗原標志.

4　研究前景

大量的臨床試驗證實，一些報道顯示關于病人的癥狀預后有很好的結果.但是，自體軟骨細胞移植被證明對于小于45歲的患者比大于45歲的患者更有效 ［19］.人的BMSCs可以向軟骨細胞方向分化，有很大的潛力來修復軟骨缺損為OA和其它的關節疾病.然而，人們還一直不清楚軟骨形成的分子機制.在細胞培養中，我們跟隨著一個雙重穩定的被氨基酸同位素（SILAC），通過向軟骨分化的第一步評估人BMSCs分泌蛋白質的量.Kopen等 ［20］將提取較純的BMSCs接種在幼年小鼠的側腦室中，試驗顯示BMSCs在側腦室內發生了轉移，其中在海馬、嗅球、紋狀體等結構中，均有BMSCs來源的神經膠質細胞和神經元細胞的高效表達.這種現象提示我們可以用BMSCs來治療神經退行性的疾病和中樞系統受損等疾病的可能.楊曉鳳等 ［21］的研究結果表明，經動脈BMSCs移植可以治療股骨頭壞死.而其關鍵之一是種子細胞的開發，即如何能大量地獲取原代細胞用于修復骨、軟骨缺損.由于同種異體移植供體來源受限，而使其應用受到很大的局限.成人的骨髓中BMSCs量很少，但是有高功能的不同方向分化的能力，能分化為特定的組織像骨、軟骨、肌肉、脂肪組織、韌帶、皮膚、骨髓基質、肌腱和其他組織.在體內移植，BMSCs也分泌多種生長因子、免疫調節細胞因子和重要的生物活性大分子包括構成再生微環境細胞來源的外來體.這個實驗通過小鼠模型描述了成人的BMSCs使軟骨形成或再生 ［22］.而在關節科，利用BMSCs來修復關節軟骨的缺損的也已成為關節外科醫師研究的重中之重.

5　結語

骨髓間充質干細胞在組織工程中的研究越來越成為目前研究的熱點.紅細胞裂解液法，能夠成功分離出BMSCs，并得到有效的鑒定.運用組織工程學的原理，使BMSCs對軟骨缺損的修復成為了可能，給臨床醫生帶來了很大的希望.