microRNA-146b在病毒性心肌炎患者血清中的表達及其臨床意義

劉佩勇　謝梅　紀玉強　趙朝　程曼麗

(陜西省西安市第一醫院心內科，陜西西安　710002)

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·論著·

microRNA-146b在病毒性心肌炎患者血清中的表達及其臨床意義

劉佩勇謝梅紀玉強趙朝程曼麗

(陜西省西安市第一醫院心內科，陜西西安710002)

摘要目的：檢測病毒性心肌炎(viral myocarditis)患者血清中microRNA-146b(miR-146b)的表達水平，并初步探討其臨床意義。方法： 選擇40例病毒性心肌炎患者和40例健康體檢者，采用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測研究對象血清中miR-146b的水平。采用電化學發光法檢測病毒性心肌炎患者血清中肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)的水平，并分析miR-146b與cTnT水平的關系。結果：病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平(1.85±0.68)明顯高于健康體檢者(1.35±0.42)，二者差異有統計學意義(t=3.957，P<0.01)。病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平與cTnT水平呈明顯正相關(r=0.635，P<0.05)。結論：病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平升高，且與心肌損傷程度相關，提示miR-146b可能參與病毒性心肌炎的病理學發病過程。

關鍵詞心肌炎；病毒性；microRNA；肌鈣蛋白T

病毒性心肌炎(viral myocarditis)是一種由病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性心肌疾病。目前，病毒性心肌炎的臨床診斷主要依靠病毒感染史、臨床表現以及心電圖、心肌損傷標志物等。另外，心內膜心肌組織活體檢查有助于確診。目前臨床上對病毒性心肌炎尚無特異性的治療方法，病毒性心肌炎經對癥治療后，多數患者預后良好，極少數患者會死于嚴重心律失常、心力衰竭或心源性休克[1-2]。microRNA(miRNA)是一類長度為18～25 bp的非編碼RNA，與靶mRNA的3’UTR完全或不完全互補結合，能調控靶基因的作用。miRNA在細胞增殖、分化及凋亡過程中發揮重要作用，參與機體的正常生理及病理過程[3-4]。microRNA-146b(miR-146b)是miR-146家族中的一員，主要調節炎性反應，在人體固有免疫過程中發揮重要作用[5-6]。國內外學者研究發現，miR-146b在病毒性心肌炎動物模型及患者的心肌組織中呈高表達[7-10]。為了進一步探討miR-146b在病毒性心肌炎的發生與發展中的作用，本研究采用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測了40例病毒性心肌炎患者和40例健康體檢者血清中miR-146b的水平，并分析miR-146b與肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)水平的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2014年3月—2015年5月在我院住院治療的急性病毒性心肌炎患者40例，其中男性19例，女性21例，年齡18～45歲，平均年齡(29.14±8.96)歲；所有病例的病理診斷均依據2001年版成人急性病毒性心肌炎診斷參考標準[11]。收集同期在我院進行體檢的40例健康者作為對照，其中男性20例，女性20例，年齡17～46歲，平均年齡(30.18±10.26)歲。兩組研究對象的性別和年齡差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究的內容，研究對象知情同意，并獲得了本院倫理委員會的批準。

1.2樣本采集入組的病毒性心肌炎患者均在治療前空腹靜脈采集5.0 mL血液，健康對照者空腹靜脈采集5.0 mL血液。將血液標本在室溫下2500 r/min離心10 min后，吸取上層血清至無RNA酶的EP管中，4 ℃條件下12 000 r/min再次離心10 min，然后收集上清液至新的無RNA酶的EP管中，-80 ℃保存備用。

1.3RT-PCR法檢測血清miR-146b水平兩組各取800 μL標本血清，用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒(購自美國Ambion公司)提取血清總RNA，然后用紫外分光光度儀測定RNA液在260 nm和280 nm波長處的吸光度(A值)，并計算RNA的濃度和純度。將A260/A280值為1.8～2.1的RNA液用于反轉錄反應。應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(購自美國ABI公司)將提取的RNA反轉錄成cDNA，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。應用TaqMan?Gene Expression Assay試劑盒(購自美國ABI公司)對miR-146b及內參18S RNA進行定量PCR擴增。擴增反應條件為：95 ℃預變性15 min，94 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共35個循環。每個樣本設立3個復孔。擴增結束后自動獲得循環閾值即Ct值，目的基因的相對表達水平采用2-△△Ct法進行分析；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt；ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct。

1.4電化學發光法檢測血清cTnT水平取100 μL病毒性心肌炎患者的標本血清，采用電化學發光法檢測血清中cTnT水平，操作嚴格按照試劑說明書進行。

2結果

2.1病毒性心肌炎患者與健康體檢者血清中miR-146b水平的比較RT-PCR擴增結果顯示，病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平為1.85±0.68，健康體檢者血清中miR-146b水平為1.35±0.42，二者差異有統計學意義(t=3.957，P<0.01)。

2.2病毒性心肌炎患者血清中miR-146b與cTnT 水平的關系統計分析顯示，病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平與cTnT 水平呈明顯正相關(r=0.635，P<0.05)。

3討論

miRNA在心血管疾病的發病過程中起重要作用，但miRNA在病毒性心肌炎中的研究尚處于起步階段。有研究[12]采用miRNA芯片技術檢測柯薩奇病毒(coxsackievirus B3，CVB3)誘導的心肌炎小鼠模型的心肌組織中miRNA的表達與正常小鼠的差異，發現22個miRNA水平下調，4個miRNA水平上調，其中miR-203通過鋅指蛋白148來促進CVB3的復制。國內學者[13]通過miRNA芯片檢測發現，在CVB3誘導的心肌炎小鼠模型的心肌組織中，miR-146a、miR-21、miR-374和miR-29a表達水平上調，而miR-23a表達水平下調。有學者[14]采用實時定量莖環RT-PCR方法研究發現，miR-155和miR-148a在病毒性心肌炎患者心臟室間隔組織中的表達水平明顯上調[14]。何進等[15]采用莖環RT-PCR方法在CVB3誘導的心肌炎小鼠模型的心肌組織中發現，miR-92a、miR-126-5p、miR-199a、miR-208b和miR-210表達水平上調，而miR-21和miR-320表達水平下調。

miR-146b和miR-146a均屬于miR-146家族成員，其中miR-146b位于人第10號染色體。miR-146b是在一項用多種細菌成分刺激人類單核細胞并檢測microRNA抗菌譜的研究中被發現的，研究證實miR-146b與炎性反應密切相關。

炎性反應和心肌纖維化在病毒性心肌炎的發生和發展過程中發揮重要作用，而miR-146b參與了這兩個過程。Corsten等[8]研究發現，CVB3誘導的心肌炎小鼠模型及心肌炎患者的心肌組織中miR-146b水平上調。國內學者也證實，心肌炎小鼠模型的心肌組織中miR-146b水平升高[7]。最近一項研究[10]發現，miR-146b在病毒性心肌炎患者的心肌組織中的水平明顯高于對照組。以上這些研究結果均提示，miR-146b在病毒性心肌炎的心肌組織中表達上調。

為了進一步研究miR-146b在病毒性心肌炎中的作用，本實驗采用RT-PCR法檢測病毒性心肌炎患者血清中miR-146b的表達水平，結果發現病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平明顯高于健康體檢者(P<0.01)，這與以往的研究[7-10]結果一致。然而，Corsten等[16]在病毒性心肌炎患者血漿中發現miR-208b和miR-499水平升高；而miR-146b的水平雖然升高，但與對照組差異無統計學意義。本研究與Corsten等的研究結果不完全一致，這可能與病例選擇、采樣時間及檢測方法等因素不同有關，同時也可能與本研究的樣本量偏少有關。故需要擴大樣本量來進一步驗證。另外，本研究還分析了病毒性心肌炎患者血清中miR-146b與cTnT 水平的關系，結果顯示病毒性心肌炎患者血清中miR-146b與cTnT 水平呈明顯正相關(P<0.05)，提示miR-146b水平與心肌損傷的嚴重程度密切相關。

綜上所述，病毒性心肌炎患者血清中miR-146b水平升高，且miR-146b與cTnT水平呈明顯正相關，提示miR-146b參與了病毒性心肌炎的病理學發病過程。但miR-146b在病毒性心肌炎中水平升高的原因及其作用機制有待進一步研究。

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Expression of MicroRNA-146b in the Serum of Patients with Viral Myocarditis and Its Clinical Significance

LIUPeiyongXIEMeiJIYuqiangZHAOZhaoCHENGManliDepartmentofCardiology,FirstHospitalofXi’anCity,Xi’an710002,China

AbstractObjective：To detect the serum level of microRNA-146b (miR-146b) in patients with viral myocarditis, and preliminarily explore its clinical significance. Methods:Forty patients with viral myocarditis and forty healthy controls were enrolled in the study. The serum level of miR-146b was detected with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The level of cardiac troponin T (cTnT) in the serum of patients with viral myocarditis was detected with electrochemical luminescence method. The relationship between miR-146b and cTnT level was statistically analyzed. Results: Compared with the serum level of miR-146b (1.35±0.42) in healthy controls, the serum level of miR-146b(1.85±0.68) in the patients with viral myocarditis increased significantly(t=3.957,P<0.01). The serum level of miR-146b was positively correlated with the level of cTnT in the patients with viral myocarditis (r=0.635,P<0.05). Conclusions: The serum level of miR-146b in the patients with viral myocarditis increased, and it was correlated with the severity of myocardial injury. It indicates that miR-146b may be involved in the pathogenesis of viral myocarditis.

Key WordsMyocarditis;Viral;MicroRNA;Troponin T

通訊作者紀玉強，E-mail：jiyuqiang112299@126.com

基金項目：陜西省西安市科技計劃項目[編號：SF1319(5)]

中圖分類號R542.2+1

文獻標識碼A