蛋白質組學技術在篩選生物標志物方面的應用研究進展

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(1.南華大學藥學與生物科學學院生物研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學礦業工程博士后科研流動站；3.南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室)

·文獻綜述·

蛋白質組學技術在篩選生物標志物方面的應用研究進展

李林蔚1，丁德馨2，李廣悅2，胡南2，易嵐1,2,3*

(1.南華大學藥學與生物科學學院生物研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學礦業工程博士后科研流動站；3.南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室)

隨著蛋白質組學技術的不斷發展，蛋白質作為生物標志物在腫瘤的早期診斷以及治療效果評價等方面的應用日益廣泛。近年來，蛋白質組學技術在環境污染預警方面的作用也日益受到關注。本文就幾種常用的蛋白質組學分離分析技術及其在腫瘤相關生物標志物、環境污染預警生物標志物篩選中的應用做一綜述。

蛋白質組學； 生物標志物； 腫瘤； 環境污染

生物標志物(biomarker)是指可以標記系統、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發生的改變的生化指標,如DNA、RNA、蛋白質、酶、脂類、糖類、代謝物等都可以作為生物標志物用于研究。生物標志物可應用于疾病的早期診斷和監測治療效果，發現治療藥物靶位[1-2]；可以闡明各種污染物的作用機理，確定各種污染物與生物體之間已發生的相互作用；此外，標志物還可以用于流行病學或毒理學研究，以判斷生物是否暴露于某些環境因素中。篩選出有用的生物標志物不但對疾病的診斷和治療有著重大的意義，并可以與生態學效應相聯系，從而制定研究解決環境問題的方案。以前常用于篩選生物標志物的方法是基因組學，隨著人類基因組測序的完成，人們發現基因的表達方式錯綜復雜，基因組學不能回答人類關于生命活動的許多問題，而蛋白質才是基因功能的實施者，了解蛋白質的結構、定位和蛋白質間相互作用和蛋白質的功能則明顯更有利于了解生命現象的本質，這便是蛋白質組學(proteomics)[3]。本文就蛋白質組學在篩選生物標志物中的研究進展綜述如下。

1 蛋白質組學技術

1.1蛋白質組學分離標記技術基于質譜數據統計分析的非標記分離方法利用蛋白質分子量和等電點不同來分離蛋白質的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)和雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)。基于和液相色譜—串聯質譜(LC-MS/MS)聯用的同位素標記技術利用同位素編碼親和標簽(ICAT)、細胞培養氨基酸穩定同位素標記(SILAC)或同位素標記相對和絕對定量標記(iTRAQ)[4]等。

1.2蛋白質組學分析技術

1.2.1 質譜技術(MS) 質譜分析是一種測量離子荷質比(電荷—質量比)的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發生電離，生成不同荷質比的帶正電荷的離子，經加速電場的作用形成離子束進入質量分析器,在質量分析器中，再利用電場和磁場使發生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。MS是不可或缺的核心蛋白質組技術,可以高度敏感和高通量鑒定蛋白質或多肽以及轉錄后修飾。最常用的MS技術包括：基體輔助激光解吸電離飛行時間質譜MALDI-TOF-MS、表面增強激光解吸電離飛行時間質譜SELDI-TOF-MS、MS/MS(串聯MS)等。近幾年MS技術發生了巨大的變化,出現新一代的質量分析器和復雜的多級儀器如四極桿飛行時間串聯質譜技術(Q-Q-TOF)和飛行時間串聯質譜儀(TOF-TOF)等[5]。

1.2.2 定向蛋白質組學 定向蛋白質組學(targeted proteomics)技術是利用質譜儀對一組經過預篩選的蛋白質樣品進行分析。這種預篩選過程是通過選擇反應監控技術(selected reaction monitoring，SRM)實現的，SRM根據待分析的目標蛋白氨基酸序列，選擇對應的蛋白質特異性肽段(proteotypic peptide，PTP)及PTP對應的高響應子離子，最后用高響應子離子的信號強度來反映該蛋白質的表達豐度。這些信號強度大且能夠確定唯一目標蛋白的肽段被稱為PTP，并與對應的高響應子離子組成一個母離子—子離子對。SRM實驗通?；谌厮臉O桿(triple quadrupole，QQQ)串聯質譜儀，也可以在線性離子阱(linear ion trap)質譜儀或者四極桿—飛行時間(Q-TOF)質譜儀上進行[6]。與目前仍占主導地位的鳥槍法蛋白質組學技術相比，使用了SRM的蛋白質探測技術速度更快，更直接。因此，以質譜為基礎的定向質譜技術的應用在更廣泛的范圍內迅速攀升，正在迅速成為一個可以替代或互補ELISA(目前蛋白質定量的金標準)的技術，并且能縮短實驗室發現的生物標志物和臨床應用之間差距[7-8]。

1.2.3 蛋白質微陣列(蛋白質芯片) 蛋白質微陣列(protein microarrays)的基本原理是將抗原、抗體、小肽、受體和配體、蛋白質-DNA和蛋白質-RNA復合物等蛋白質有序地固定于滴定板、載玻片等各種載體上制成芯片，然后，用標記了特定熒光的蛋白質或其他成分與芯片作用,洗去未能與芯片上的蛋白質互補結合的成分,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術,測定芯片上各點的熒光強度,通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關系,由此達到測定各種蛋白質的目的。蛋白質微陣列可分蛋白檢測芯片和蛋白功能芯片。蛋白檢測芯片將具有高度親和特異性的探針分子(如單克隆抗體)固定在基片上，用于識別復雜生物樣品中的目標蛋白/多肽。蛋白質功能微陣列是在陣列上包含完整的功能蛋白質/域,可以研究蛋白質的一個特殊亞型或整個蛋白質組的生物化學活性[4,9]。

2 蛋白質組學在腫瘤相關生物標志物篩選中的應用

2.1蛋白質組學在肺癌相關生物標志物篩選中的應用肺癌是癌癥死亡的最常見原因之一，5年存活率在所有癌癥中是最低的，只有15%。肺癌的死亡率高，不僅是由于晚期診斷，而且即使被診斷為I期肺癌患者也缺乏有效的治療方法。因此，迫切需要發現新的生物標志物用于肺癌的診斷、預后評估以及打開新的治療途徑。

2.1.1 肺癌的診斷 Ding等[10]通過研究92例肺癌患者、38例細菌性肺炎患者和42例健康對照的血清和胸腔積液，發現肺癌患者中胸腔積液/血清的轉甲狀素蛋白TTR比值較細菌性肺炎患者的更高，應用MALDITOFMS分析發現肺癌患者和細菌性肺炎患者的血清中有4個對應TTR、Sul-TTR、Cys-TTR和Cysgly-TTR的主要峰，肺癌患者胸腔積液中的Cysgly-TTR比例增高，研究數據表明，結合胸腔積液/血清TTR比值和修飾后TTR能更有效的區別診斷肺癌患者與細菌性肺炎患者。

2.1.2 肺癌的預后評估 化療是大多數肺癌患者的標準治療方法，而只有少數晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者化療有效，所以通過生物標志物評估肺癌患者化療治療的預后尤為重要，Voortman等[11]應用MALDI-TOF-MS研究27例NSCLC患者用順鉑—吉西他濱和硼替佐米化學治療的血清肽質譜，從血清肽豐度的動態變化發現，一種13肽標志物在區別患者治療后是短的無惡化存活期(PFS)還是長的無惡化存活期上具有86%準確率、100%靈敏度和73%特異性，一種5肽標志物在區分患者對治療是部分應答還是不應答具有89%準確率、100%靈敏度和83%特異性。由于長的PFS和較長的總生存率相關，所以分析這些血清多肽組可能有助于預測晚期NSCLC患者的化療治療效果。

2.1.3 肺癌的新治療靶點 由于肺癌的80%以上都是NSCLC，所以找到治療NSCLC的靶點可以有效提高肺癌的5年存活率，Shaomin等[12]在三位手術NSCLC患者中取得約250 mg的腫瘤組織和非腫瘤鄰近組織，并用2D-DIGE技術從這兩種組織的組織間質液(TIF)中得到24個差異蛋白質點，應用LC-MS/MS技術分析這24個差異蛋白質后，發現腫瘤組織的TIF過氧化物酶基因1(PRDX1)的表達上調，最后用ELISA驗證了40例NSCLC患者平均為36 ng/mL的PRDX1明顯高于20例肺良性疾病患者平均6.26 ng/mL的PRDX1，研究表明，PRDX1可能與NSCLC的淋巴結轉移及分化程度相關，PRDX1可以歸因于惡性轉化的NSCLC，并且可能成為NSCLC的治療靶點。

2.2蛋白質組學在胰腺癌相關生物標志物篩選中的應用胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一個治療方法有限的致命惡性腫瘤，具有非常高的死亡率，降低PC的死亡率不僅需要技術的進步，而且需要檢測出對PC具有高特異性的新生物標志物。由于晚期PC的5年存活率低，所以可以檢測出疾病蔓延前階段的早期診斷標記就可以改變PC患者的命運[13-14]。Pan等[15]應用基于SRM技術的定向蛋白質組學研究PC患者，慢性胰腺炎患者和正常人的血漿樣本中一組候選癌癥生物標志物的含量，這5個候選癌癥生物標志物包括人分層蛋白(14-3-3 protein sigma)、凝溶膠蛋白(gelsolin)、光蛋白聚糖(lumican)、谷氨酰胺轉移酶2(transglutaminase 2)和組織金屬蛋白酶抑制1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1)。研究發現，凝溶膠蛋白、光蛋白聚糖及組織抑制劑金屬蛋白酶1可能比CA19-9更能分辨PC患者和慢性胰腺炎患者或正常人。除此之外，結合相補充的個體生物標記物可能在原有的特異性上提高生物標志物的靈敏度，比如，雖然光蛋白聚糖可以很好的區分癌癥和健康對照者,但難區分癌癥和胰腺炎,凝溶膠蛋白能更好的區分癌癥和胰腺炎。比起光蛋白聚糖或凝溶膠蛋白各自單獨作為生物標志物，兩者一起,作為一個聯合生物標志物小組,可以表現出更高的靈敏度同時有95%特異性。所以，定向蛋白組學可以補充ELISA方法應用于驗證這些候選生物標志物在臨床應用中的潛在實用性[16]。

2.3蛋白質組學在肝癌相關生物標志物篩選中的應用肝細胞癌(HCC)是全球主要的致命癌癥，盡管有很多診斷方法，然而小肝結節等疾病與HCC的鑒別診斷仍然困難。先進的成像技術，聯合輔助生物標志物磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、谷氨酰胺合成酶(GS)和熱休克蛋白70(HSP70)可以增強診斷的準確性，但是，仍需準確性靈敏性更高的生物標志物來輔助鑒別診斷。Reis等[17]用非標記技術和凝膠型蛋白質組學篩選出HCC(18例)和對應的非腫瘤肝組織(NTLT)的一批差異候選蛋白質，進一步在HCC(78例)，肝細胞腺瘤(25例;HCA)，局灶性結節性增生(28例;FNH)，肝硬化(28例)中比較這些已知蛋白質生物標志物的診斷準確率，發現14-3-3 Sigma(14-3-3S)顯示出最顯著上調(58.8倍)，并相對GPC3(64.7%)和GS(45.4%)有著更好的診斷準確率(73.0%)，且具有高靈敏度(96.0%)。所以，14-3-3S是一個有潛力的蛋白質生物標志物，可以進一步改善肝細胞腫瘤鑒別診斷過程的準確性。

3 蛋白質組學在環境污染預警生物標志物篩選中的應用

3.1空氣污染預警生物標志物篩選隨著生活質量越來越好，人們的生存環境卻越來越差，各種工業過程、供熱、烹調過程中燃煤與燃氣或燃油排放的煙塵、交通工具向大氣中排放的尾氣等污染造成城市空氣質量下降，對人類健康造成巨大的危害。顆粒物PM(particulate matter)可以通過呼吸進入人體危害健康引發疾病，粗顆粒PM10(直徑2.5～10.0 μm)就可以吸入肺部，通常沉積在上呼吸道；細顆粒PM2.5(直徑<2.5 μm)可深入到細支氣管和肺泡；而超細顆粒(UFPs)和納米顆粒NP(直徑<0.1 μm)為人體的危害更大[18]。Kang等[19]用蛋白質組學分析對比正常環境下小鼠哮喘模型和暴露在含有多環芳香烴(PAH)的UFP環境下小鼠哮喘模型的支氣管肺泡灌洗液蛋白組，發現實驗組支氣管肺泡灌洗液蛋白組有蛋白質表現出顯著增強的上調，分別是多聚免疫球蛋白受體、補體C3、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、幾丁質酶3樣蛋白3、幾丁質酶3樣蛋白4和酸性哺乳動物幾丁質酶，研究中發現NGAL也許可以修復UFP引起的毒性，并可能是確定呼吸道氧化應激狀態的有效生物標志物。所以生物標志物的研究將發現這些不利健康的顆粒對人體產生相關臨床表現前的早期生物事件提供有價值的預警信息[20]。

3.2核污染預警生物標志物篩選隨著放射性物質和電離輻射設備在國民經濟各領域中的廣泛應用，這些放射性物質本身或者其遺留物對生物環境和人類造成的破壞也日益受到關注。這些核輻射物質可以通過多種途徑進入生物體內，成為“隱形殺手”，對生物物種造成各種損害[21]。因此，篩選出檢測速度快、對輻照敏感核污染預警生物標志物，不僅為核污染的生物防護工作打下基礎，而且對生物物種甚至人類起到保護作用。

近年，公眾越來越關注低劑量輻射對健康的影響。雖然高劑量率輻射暴露細胞反應的分子事件已得到充分的研究，但是長期暴露于極低劑量率輻射的影響目前尚不清楚。Nakajima等[22]通過二維電泳分析在低劑量率(0.032 μGy/min、0.65 μGy/min和13 μGy/min)照射485天的小鼠肝臟中蛋白的表達，發現其中一種蛋白質表現出顯著的表達變化，被確定為硫氰酸酶(硫代硫酸硫轉移酶)，研究結果表明，硫氰酸酶是一種由低劑量率輻射引起的新蛋白質，并進一步分析能夠提供發現極低劑量率輻射暴露的影響。這種蛋白可能成為明確低劑量輻射效應和新防御系統的關鍵[22]。

隨著蛋白質組學研究方法的更新和研究數據的不斷積累，越來越多的生物標志物被發現，但是，篩選出來的生物標志物是否能達到實際應用的要求，還需要大量的研究和驗證。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.025

2015-01-07；

2015-3-10

國家自然科學基金(81400117)，國防基礎科研重點項目(B3720132001)，中國博士后基金(2014M562115)，湖南省自然科學基金(2015JJ4042).

*通訊作者，E-mail:yilanoky@126.com.

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(此文編輯：朱雯霞)