梅毒疫苗發展的需求、挑戰與前景

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(南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001)

·文獻綜述·

梅毒疫苗發展的需求、挑戰與前景

朱洪，江銀波，余堅，曾鐵兵*

(南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001)

梅毒是由蒼白密螺旋體蒼白亞種即梅毒螺旋體(Tp)引起的一種性傳播疾病，盡管可被廉價有效的抗生素治愈，但依然在發展中國家流行和發達國家再現，嚴重危害公眾健康。感染性梅毒給全球帶來醫療負擔，先天性梅毒被認為是影響全球胎兒和新生兒最重要的感染性疾病，梅毒感染還會增加感染和傳播艾滋病的風險。全球梅毒的高發和防治該病的失敗，使得對梅毒疫苗的需求迫在眉睫。在動物模型中用γ射線致弱的Tp長期免疫動物獲得了完全保護，提示了發展梅毒疫苗的可行性及Tp外膜表面成分在誘導免疫保護中的重要性。梅毒適宜發展疫苗用于防治，但實現這一目標前需要解決好參與人員、研究以及市場問題。

梅毒； 蒼白密螺旋體； 疫苗； 外膜蛋白

梅毒是梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)導致的一種慢性性傳播疾病(STD)。感染性梅毒是全球流行的一種威脅公眾健康的疾病，WHO估計全球有3600萬感染者和每年超過1100萬的新增患者[1]，其中超過90%的病例在發展中國家，近年許多發達國家再次出現。中國梅毒近年來發病數呈快速增長趨勢，以先天梅毒和男—男同性接觸(MSM)伴艾滋病性梅毒增長[2]尤為明顯。先天性梅毒在低收入國家被認為是與流產和死產的最相關因素，每年有50多萬例先天性梅毒出現[3]。有癥狀的梅毒感染能提高2至5倍感染和傳播艾滋病的風險[4]。梅毒疫情和危害已成為中國乃至全球高度關注的公共衛生問題，中國政府出臺了《中國預防與控制梅毒規劃(2010～2020年)》以遏制梅毒疫情的蔓延[5]。

青霉素治療梅毒感染已有70余年，至今Tp對其仍十分敏感，引發了是否需要研發梅毒疫苗的強烈爭議。盡管有集中控制梅毒的舉措和廉價有效治療梅毒的藥物，但全球梅毒感染率仍持續升高，而且青霉素的二線替代藥物如大環內酯類抗生素的耐藥性已在許多國家出現，以至于被拒絕用于治療和預防梅毒。因此，控制梅毒不能僅僅依靠篩選和治療梅毒，迫切需要發展和使用梅毒疫苗作為補充，而前提是需要深入研究梅毒發病機制和篩選確定梅毒疫苗靶抗原。有效梅毒疫苗研發成功，將明顯降低成人梅毒及先天性梅毒的發生率，有效控制梅毒對艾滋病的防御也具有顯著積極的影響。

1 梅毒發病機制

1.1 Tp生物學特征Tp屬于螺旋體科密螺旋體屬，人是Tp的唯一宿主。1998年，Tp(Nichols株)全基因組被測序，在隨后的測序中發現密螺旋體亞種間基因序列同源性高達99.8%以上[6]。Tp是一類生物學性狀十分獨特的原核細胞型微生物[7]：(1)缺乏代謝酶，不能像大多原核細胞微生物一樣體外人工培養；(2)有28%基因與其它物種無同源性，為新基因；(3)不可培養和不可進行遺傳操作(基因敲入或敲出)；(4)外膜蛋白(OMP)十分稀少，僅為大腸埃希菌的百分之一，缺乏敏感的鑒定方法，而且外膜十分脆弱，鑒定OMP十分困難；(5)雖為革蘭陰性菌卻缺乏脂多糖(內毒素)和III型分泌系統、菌毛及莢膜，也不產生明顯的外毒素。Tp這些特殊的生物學性狀是阻礙研究Tp致病機制和疫苗的主要原因。

1.2梅毒的自然感染史自然情況下未經治療的梅毒會出現第一階段的硬下疳和第二階段的散發性皮疹。隨后是無癥狀潛伏期，該期會在大多數人中持續一段時間。在無抗生素的時代，約30%的個體會在10～50年后發展為三期梅毒并對其威脅生命。梅毒自然發展過程有利于洞察Tp建立和維持感染的發病機制。高度的侵襲力和免疫逃避形成持續感染的能力是Tp生存的兩個必要因素。

1.2.1 Tp的高度侵襲能力 Tp通過胎盤傳播導致先天性梅毒，至少40%的早期梅毒患者中樞神經系統受到過Tp侵襲，二期梅毒出現廣泛皮疹和導致肝、腎及眼部癥狀，這些都表明Tp具有高度侵襲力[7]。Tp在感染動物數小時內，可通過血液和淋巴播散[7]。體外實驗也顯示Tp可以穿透完整的膜和內皮細胞層[7]。Tp入侵組織后只能附著在細胞上(如毛細管內皮細胞)。Tp0136[8]、Tp0155、Tp0483[9]和Tp0751[10-12]幾個蛋白能以細胞外基質為橋梁吸附宿主細胞。Tp的侵襲能力對形成臨床表現至關重要，消除這種能力將防止傳染性梅毒的傳播、先天性梅毒的形成和個體梅毒的感染進程，是發展梅毒疫苗的中心環節。

1.2.2 梅毒早期病變的消除 一期和二期梅毒病變主要有T細胞浸潤，隨后為巨噬細胞(Mφ)。Mφ浸潤后不久清除絕大多數Tp。Th1型細胞產生γ干擾素募集并激活Mφ使其能吞噬抗體調理的螺旋體并將其殺滅。大部分Tp被清除但仍然會有一部分Tp存在，這些局部殘留的Tp能抵抗Mφ的調理吞噬作用，Tp的免疫逃逸對形成梅毒終生慢性感染至關重要。

1.2.3 Tp持久感染的原因 在梅毒感染早期癥狀自發消除后，進入一段無癥狀慢性感染時期，稱之為“潛伏期”。Tp這種持續生存能力可能與下列因素有關：(1)Tp隱藏在“免疫豁免”部位如中樞神經系統、眼睛或除吞噬細胞外的其它細胞內；(2)Tp外膜蛋白稀少，抗原靶位有限，在梅毒逃逸免疫應答中起重要作用；(3)Tp表面的Tpr家族蛋白抗原的多樣性和變異性[13-14]。最近發現Tp存在兩種抗原類型變異：①通過改變基因啟動子區域的polyG長度，階段性表達或不表達TprE、TprG和TprJ[15]；②TprK分散區域序列在密螺旋體亞種間、Tp株間甚至株內的變異[16]。Tpr家族的TprC和TprD都在其株間和亞種間存在異質性，但TprC和TprD序列在感染過程中卻似乎保持不變。這些多變的區域預測為表面結構[17]，并且認為TprC是抗體調理素的靶位[13]，這有助于部分解釋人多次感染梅毒可能是因為不同菌株表達不同的TprC和TprD序列。發展疫苗時需要考慮抗原變異性，應集中針對這些重要蛋白抗原的恒定區。

1.3 Tp研究中的技術難題阻礙了Tp外膜蛋白的鑒定Tp不可人工培養和遺傳操縱、OMP稀少、外膜脆弱等因素阻礙了對其OMP的鑒定。為了避免這些限制，研究者應用生物信息學分析和結構預測[13,18]等方法，證明了一些蛋白具有功能活性如對宿主成分粘附作用[8-12]、抗體調理素的靶位[19-20]、抗原變異[14]等。至今為止鑒定的候選表面外膜蛋白主要包括：粘附素Tp0136、Tp0155、Tp0483和Tp0751[8-12]；Tpr家族蛋白中TprK(Tp0897)[14]、TprC/D(Tp0117/131)[13,17]、TprI(Tp0620)與TprF(Tp0316)[21]；Tp92(Tp0326)[22]；Tp0966-Tp0969[23]。這些都是重要的梅毒疫苗的候選分子。

2 梅毒動物模型

雖然有些哺乳動物能夠感染Tp，但極少會發展為臨床疾病。兔是唯一能出現人類梅毒感染多個階段和慢性特點的實驗室小型動物，適宜用做研究梅毒致病機制和免疫機制的動物模型。過去的數十年中，均采用新西蘭兔進行梅毒研究，但由于不能獲得近交系株和缺乏兔免疫檢測試劑，限制了兔模型的免疫學研究。近年來，建立了一些檢測兔細胞因子的方法，但需發展更多的檢測方法。

3 Tp天然表面抗原是疫苗的關鍵成分

3.1理論依據1973年Miller在37周內給新西蘭兔靜脈注射經γ射線致弱的Tp，獲得了長達一年抗同株Tp攻擊的完全保護。盡管這種免疫方案不適合用于人類，但該研究具有開創性意義，建立了理論上完全保護的動物模型，同時深刻認識到Tp表面抗原對保護作用起著決定性作用。使用滅活疫苗失敗是由于用物理或化學處理Tp時破壞了其表面不穩定的抗原。雖然大多數研究者將焦點集中于Tp的OMP上，但需要提醒的是Tp的表面膜含有脂質，Miller所使用的免疫原中包含了這些脂類抗原，用其免疫兔可產生調理素抗體獲得部分保護性。此外，全Tp免疫小鼠可產生高度中和作用的單克隆抗體，該抗體能特異性結合Tp磷酸膽堿抗原表位，被動轉移該抗體能顯著降低Tp感染[24]。

3.2延長形成保護的時間Miller用γ射線致弱的無繁殖力的Tp靜脈注射新西蘭兔獲得完全保護需要37周，而免疫24周和12周僅分別獲得部分保護或不能免疫保護。Miller的研究也證實了之前的觀察，即動物模型內的免疫保護可防止同源Tp的再感染。抵抗有癥狀的同源株Tp感染的完全保護僅在Tp感染12周后才會出現。如果兔前12周階段受到感染得到治愈，可以在12周后再次被感染。現在推測這種免疫保護緩慢的變化與Tp細菌上特殊的表面蛋白稀少有關。這些觀察結果，結合Miller的保護性研究，表明表面抗原在有效梅毒疫苗中的重要性，是有效疫苗的靶抗原成分。

4 免疫保護的相關因素

4.1兔感染模型中的免疫保護相關因素感染過程中，病變處先出現Th1細胞應答，隨后為抗體調理Mφ吞噬殺死而清除Tp。單獨的抗體并不能消除Tp感染，T細胞的過繼轉移只能短暫且不完全抵抗感染。從過去疫苗研究過程中得出的結論是，保護兔免受最初感染既依賴于Th1細胞應答(T細胞浸潤及產生γ干擾素)，也需要調理素抗體的作用。國外研究常以Ribi佐劑(含單磷脂酰A、合成海藻糖和細胞壁骨架)誘導Th1細胞應答和功能性抗體產生，以重組蛋白加Ribi佐劑可誘導較明顯的保護作用[19-20]。但商品化的Ribi佐劑已不再生產，曾嘗試過其它佐劑但降低了保護作用，因而需要發展和應用其它的佐劑用于梅毒疫苗研究。

4.2人類對Tp感染的免疫應答目前對人類的免疫知之甚少。眾所周知，患過梅毒的人群可反復感染。研究表明，晚期潛伏梅毒患者將可以抵抗異源Tp株的再次感染不出現癥狀，但那些更早階段的患者可再次感染，這與Miller在動物中使用疫苗若要誘導完全保護需長期的免疫周期是一致的。在兔體內形成的免疫具有Tp亞種甚至株的特異性，這種特異性很可能與Tp株間抗原差異有關。因此，研發梅毒疫苗不但需要長期的免疫過程，而且在選擇免疫原時需要注意菌株中抗原多樣性和抗原變異在免疫逃避中的作用。

5 梅毒疫苗研發必需考慮因素與益處

5.1疫苗的關鍵需求開發和生產有效梅毒疫苗至少需要幾個關鍵需求：(1)疫苗需要防止初期的硬下疳和二期病變的形成以阻斷梅毒和艾滋病的傳播，抑制Tp在宿主內播散，阻止梅毒發展和形成先天性梅毒。(2)由于在梅毒感染期間調理吞噬作用對Tp的清除起關鍵作用，因此疫苗需要有效激發Th1型應答和調理素抗體產生。(3)疫苗能廣泛保護機體免受各種Tp菌株的感染。采用單一Tp蛋白無法滿足這些需求，因此有效疫苗需要多個組分組成。

5.2需要解決的問題經過近一個世紀的研究，人們在兔感染模型中對免疫保護相關因素有了深入的了解。然而，疫苗的成功研制還需要通過在基礎研究實驗室和臨床之間的信息交流，以進一步了解對人類的相關保護。發展適當有效佐劑必不可少并可能需要工業化生產。在疫苗研究領域中需要大規模應用“組學”方法和數據分析來全面理解Tp，如在Tp亞型和Tp株間的基因和蛋白表達差異。當前最重要研究任務是明確Tp的表面抗原，不僅包括OMP，也需要延伸范圍至非蛋白抗原(如膜脂抗原)和經糖基化或甲基化翻譯后修飾的表面蛋白。完成這些目標需要一大批從事梅毒基礎研究的科學家投入到該領域進行持續研究，將面臨技術障礙和和高額的研究經費問題。此外，為促進梅毒疫苗的發展，需要對發達國家市場做出準確評估，應考慮應用梅毒疫苗可降低艾滋病發生率以及疫苗發展帶來的行業利益。

5.3梅毒疫苗研發的益處多種原因有利于研發梅毒疫苗：(1)Tp僅寄生于人體，在全球成功接種可有效消除這種疾病。(2)兔動物模型展示了人類感染初期、二期和三期各階段的特征，可采用適當的候選疫苗進入臨床前研究以準確評估其保護性能。(3)Tp對青霉素高度敏感，即使在疫苗保護試驗失敗后仍可用青霉素完全治愈，這將極大吸引志愿者參與臨床試驗及廠商贊助。(4)射線致弱Tp可誘導完全保護為發展梅毒疫苗提供了可行性。雖然由脂質和外膜蛋白的Tp外膜給疫苗研究造成了困難，但Tp相對簡單的表面又有利于梅毒疫苗的研發。事實上，如果梅毒疫苗成分被發現，將減少疫苗研發的費用，使生產過程流水化，提高生產梅毒疫苗的行業利益。

疫苗接種被認為是世界上最重要和節省成本的公共衛生舉措，因為其為社會帶來積極的健康效應和經濟效益。由于梅毒給全球造成持續性負擔，增加傳播艾滋病的風險，感染性梅毒和先天性梅毒顯著的發病率及死亡率，從概念上、戰略上和財政支持上都迫切需要研發疫苗預防梅毒這一嚴重疾病。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.026

2015-01-07；

2015-03-23

國家自然科學基金項目(81273322)；湖南省衛生廳課題(B2013—035).

*通訊作者，E-mail：nhdxztb@126.com.

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(此文編輯：蔣湘蓮)