曲古抑菌素A在腫瘤免疫治療中的作用及機制

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.006

基金項目：國家自然科學基金海外及港澳學者合作研究基金（31428005）；國家自然科學基金（81171653、30950022）；江蘇省自然科學基金（BK2011246）；江蘇省條件建設與民生科技專項資金（BL2014034）

作者單位：213003 常州，蘇州大學附屬第三醫院腫瘤生物診療中心

通信作者：蔣敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

收稿日期：2015-06-08

表觀遺傳學（epigenetic）修飾是基因表達調控的重要形式之一，即在不改變特定基因核苷酸序列的情況下，通過DNA 的乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化的共價修飾作用使基因表達發生可遺傳的變化，從而改變細胞功能 [1]。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi）是基于表觀遺傳學理論發現的一類新型抗腫瘤藥物，因其廣譜、高效、低毒，抗腫瘤效果良好，具有較好的應用前景。曲古抑菌素 A（trichostatin A，TSA）來源于鏈霉菌代謝產物，是最早被應用于臨床抗腫瘤治療的 HDACi 家族成員之一。TSA 以組蛋白去乙?；福℉DAC）為靶點，通過抑制 HDAC 的活性，有效上調細胞中組蛋白乙?；?，促進細胞分化，阻滯細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡，從而促進抗腫瘤轉錄因子的轉錄及表達，調控相關信號通路，發揮抗腫瘤效應 [2]。

腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）是繼手術、化療、放療后第四種腫瘤綜合治療手段，因其能改善患者腫瘤微環境，提高機體抗腫瘤免疫反應，且毒副作用小，與手術等其他治療手段協同效果好，受到越來越多的關注 [3]。有學者認為，未來大部分腫瘤患者將主要接受免疫治療 [4]。盡管腫瘤免疫治療應用前景廣闊，但由腫瘤相關的免疫抑制細胞（如 Treg、MDSCs）及免疫抑制因子（如 TGF-β、PD-L1、FasL）等引起的腫瘤免疫耐受是腫瘤免疫治療失敗的常見原因。因此，腫瘤的綜合治療模式仍是目前腫瘤治療的主要研究方向。TSA 以往主要應用于抗腫瘤的基礎研究及臨床藥物試驗，近期研究表明，TSA 在多項腫瘤聯合免疫治療中均顯示出較強的協同及增強作用，為腫瘤免疫治療提供了新的思路?，F就 TSA 在腫瘤免疫治療中的作用及機制綜述如下。

1　生物學特點與功能

組蛋白乙?；墙M蛋白共價修飾的形式之一。組蛋白乙?；D移酶（HAT）通過改變核小體結構，使組蛋白染色質結構疏松，進而開啟基因的轉錄、表達 [5]。HDAC 作用則正好相反，在其影響下組蛋白賴氨酸殘基上的乙?；灰迫?，使染色質與組蛋白結合得更緊密，引起基因轉錄抑制 [6]。兩者共同維持乙?；Ｋ?。

TSA 是一種強效、特異并且可逆的 HDAC 抑制劑，為氧肟酸鹽類化合物，是第一個被發現能抑制 HDAC 的天然氧肟酸，可作用于第 I、II 類 HDAC。TSA 主要通過其氧肟酸基團與底物競爭性結合 HDAC 上的鋅離子，使HDAC 失活，從而發揮抑制作用。研究證實，TSA 可持續誘導 p21 基因表達上調，這與該基因啟動子 HDAC 和c-myc 結合減少有關 [7]。TSA 在提高多種抑癌轉錄因子乙酰化水平的同時，也能抑制腫瘤細胞的生長，促進其凋亡。

2　抗腫瘤作用機制

2.1 阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡

TSA 通過上調細胞周期蛋白激酶（CDK）抑制劑 p21、p27 的表達以及下調細胞周期蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin D2 的含量，抑制 CDK 的活化，從而使腫瘤細胞停滯在 G1 或 G2 期，阻滯腫瘤細胞繼續生長 [8]。Alao 等 [9]研究表明，TSA 可以在 MCF-7 系乳腺癌細胞中迅速降解cyclin D1，使乳腺癌細胞的細胞周期停滯于 G0/G1 期。Noh 等 [10]報道，TSA 作用于 HeLa 細胞時可以降低 cyclin B1、PLKl 和 survivin 蛋白表達水平，同時上調 p21 的表達，導致細胞周期停滯于 G2/M 期。

TSA 主要通過外源性及內源性兩條途徑介導細胞凋亡。外源性途徑主要通過上調多種死亡受體，如 TRAIL、FasL、TNF 等，激活腫瘤細胞與相應配體的結合，誘導caspase-3 及 caspase-8 介導的細胞凋亡通路，導致細胞凋亡。內源性途徑通過釋放線粒體間膜蛋白顯著降低線粒體間膜電位，從而激活 caspase 途徑，誘導細胞凋亡。Taghiyev 等 [11]研究發現，TSA 通過激活 caspase-9 途徑，導致線粒體釋放細胞色素 C 和線粒體間膜蛋白，通過線粒體途徑誘導凋亡的發生，研究者預先阻斷 caspase-9 激活途徑，導致細胞抵抗 TSA 誘導的凋亡，表明線粒體途徑在 TSA 誘導細胞凋亡中的重要作用。

2.2 抑制腫瘤血管生成

腫瘤的生成大多與微環境缺氧有關。在缺氧的情況下，由于 HDAC 過度表達導致抑癌基因 p53 和 VHL 轉錄受阻，引起缺氧誘導因子 HIF-1α 和血管內皮生長因子 VEGF過度表達，促進腫瘤血管生成 [12]。研究表明，TSA 主要通過下調因缺氧而導致的腫瘤血管生成相關基因的表達以及直接抑制內皮細胞的遷移和增殖，從而抑制腫瘤血管生成 [13]。Yang 等 [13]發現在人骨肉瘤中，TSA 通過抑制 HIF-1α 及 VEGF 的表達，誘導其受體降解，并通過上調 p53 和VHL 的轉錄，從而抑制腫瘤血管生成。同時，TSA 亦能上調 VEGF 抵抗劑 sema-phorin 3 的表達。

2.3 誘導腫瘤細胞分化

TSA 能在不殺傷腫瘤細胞的情況下，誘導去分化腫瘤細胞向正常細胞方向分化。目前研究表明，TSA 對包括乳腺癌、子宮內膜癌、肝癌等在內的多種腫瘤細胞具有誘導分化的能力。Uchida 等 [14]證實，TSA 可通過誘導階段特異性蛋白 glycodelin 的表達，促進人子宮內膜癌細胞的分化。Rahman 等 [15]用 TSA 作用于髓系白血病細胞株 RAW264，發現 TSA 促進細胞向巨噬細胞分化而不向破骨細胞分化。

3　在腫瘤免疫治療中的作用

TSA 不僅對腫瘤細胞有直接的細胞毒作用，更在機體免疫系統中發揮多種免疫調節作用，促進抗腫瘤免疫療效。時玉舫團隊揭示了 TSA 通過抑制腫瘤浸潤 T 細胞凋亡，提高抗腫瘤免疫效應，能有效抑制腫瘤生長 [16]。進一步研究發現，TSA 通過抑制 Fas-FasL 通路介導的免疫細胞“激活誘導的細胞凋亡（activation-induced cell death，AICD）”過程減少細胞死亡，從而抑制下游凋亡信號的激活。同時，他們團隊還發現 TSA 和 CTLA4 單抗的聯合應用可極大地促進 CD4 +T 細胞的浸潤，發揮抗腫瘤免疫治療的協同作用 [16]。

3.1 促進腫瘤細胞被免疫細胞識別

對腫瘤細胞的識別和清除主要由腫瘤特異性 T 細胞執行，除此之外，還依賴于腫瘤相關抗原（TAAs）以及 MHC I 類分子的表達水平。TSA 可以通過上調 MHC I 類分子、共刺激分子以及黏附分子的表達水平提高腫瘤細胞的免疫原性，導致 IFN-γ 分泌 T 細胞的活化 [17]并增強 CTL 細胞對腫瘤細胞的殺傷能力 [18]。在小鼠漿細胞瘤研究中還證實，TSA 通過激活 pIII-CIITA 啟動子誘導 MHC II 類分子的表達，導致 CD4 +T 細胞的擴增 [19]。此外，TSA 能夠在抗原肽缺陷小鼠的細胞系中增加或誘導抗原肽轉運基因TAP-1、TAP-2 以及 LMP-2 的表達 [20]。NK 細胞通過活化受體 NKG2D 與其配體 MICA/MICB、ULBPs 的識別途徑清除腫瘤細胞，發揮抗腫瘤免疫效應。TSA 誘導腫瘤細胞表面 MICA/MICB 高表達，促進 NK 細胞對腫瘤細胞的識別 [21]。López-Soto 等 [22]發現 TSA 可以促進 ULBPs 在上皮細胞瘤中的表達。

3.2 對抗原提呈細胞以及細胞因子的作用

抗原提呈細胞（APC）既是固有免疫的一部分，又能通過雙信號途徑激活 T 細胞，因此 APC 又是獲得性免疫的啟動者。而促炎細胞因子的釋放是許多疾病發生和發展的原因。HDACi 多次被證實阻礙 APC 協同刺激能力和促炎性細胞因子的產生。在小鼠骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）和樹突狀細胞（BMDC）中，TSA 能顯著下調共刺激分子的表達以及細胞因子的產生 [23-24]。該研究中，BMDC 經由TSA 處理后，其表達的共刺激分子 CD40、CD80、CD86、CCR 與促炎性細胞因子 IL-6、IL-12、TNF-α 均被下調 [24]。然而，在腹膜巨噬細胞中，TSA 上調 IL-12 的同時下調IL-10 的表達 [25]。對于兩種截然不同的研究結果，一種假說是 TSA 加入的時間點不同，第一組實驗 TSA 在抗原提呈細胞被激活前 1 小時加入，第二組實驗 TSA 與激活劑同時加入?？梢娍乖岢始毎幕罨c否對 TSA 產生了不同的影響。與其形成鮮明對比的另一種假說是，TSA 在BMDM 中不僅沒有下調 IL-12 的表達，相反可以防止IL-12 減少的產生。另有研究報道，TSA 通過減少促炎性細胞因子的產生下調小鼠全身性炎癥反應 [26]。相似的效果在人類巨噬細胞和樹突狀細胞中也有呈現。此外，TSA 還影響轉錄因子的活化。Nencioni 等 [27]研究發現，在單核細胞來源的 DC 細胞中，TSA 通過阻斷 NF-κB 和 I 型 IFN信號通路減少細胞因子的產生，并抑制 DC 的分化和功能。除此之外，在人類腫瘤細胞系和小鼠外周血中同時發現，TSA 可以減少促腫瘤生成細胞因子巨噬細胞游走抑制因子（MIF）的產生 [28]?？偠灾?，TSA 通過減少共刺激分子的表達以及促炎性細胞因子的產生來抑制抗原提呈細胞的功能。

3.3 TSA 對效應淋巴細胞的作用

CD4 +效應 T 細胞是適應性抗腫瘤免疫應答的重要組成部分。研究顯示，HDACi 對 CD4 +細胞的細胞活性與功能具有抑制作用。Moreira 等 [29]用 TSA 處理小鼠 CD4 +細胞后發現，TSA 能夠抑制 PMA/ionomycin 刺激轉錄因子NF-κB 被轉運到細胞核內，促進 NF-κB 依賴的基因轉錄的能力，并伴隨時間的延長損害 CD4 +細胞的活性。TSA能夠影響 CD4 +細胞表面特異性抗原的表達，這與其上調細胞周期性蛋白依賴性激酶抑制因子 p21 表達有關 [30]。以上研究均顯示 TSA 妨礙 CD4 +細胞抗腫瘤免疫應答的產生。

在有效的抗腫瘤免疫應答中，CD8 +效應 T 細胞的細胞毒性作用是至關重要的。一些研究顯示，HDACi 能增強CD8 +細胞的功能。TSA 能夠上調與 CD8 +活化和產生免疫記憶性相關基因的表達水平 [31]。研究表明，記憶性 CD8 +細胞產生 IFN-γ 的能力依賴于 CD4 +輔助性細胞的存在，并且只有在 CD8 +記憶性 T 細胞中，IFN-γ 位點才能被高度乙酰化從而分泌大量 IFN-γ，迅速啟動抗腫瘤免疫功能[32]。

盡管 HDACi 抗腫瘤作用之一來源于 NK 細胞對腫瘤的識別能力，但是 HDACi 對 NK 細胞自身的作用報道并不多。Ogbomo 等 [33]首次證實聯合使用 HDACi 與 IL-2 可通過下調 NK 細胞活化受體相關激活信號通路從而抑制人類 NK 細胞的增殖能力和細胞毒性作用。另一項研究同時證實，HDACi 對 NK 細胞功能的影響并非由于其誘導 NK細胞凋亡所致，NK 細胞仍能通過釋放穿孔素、顆粒酶殺傷腫瘤細胞 [34]。Rossi 等 [35]研究發現，TSA 抑制由 IL-12、IL-15 以及 IL-18 激活的 CD56dim/bright NK 細胞 IFN-γ的產生，并削弱 NK 細胞對 K562 細胞的細胞毒性作用。同時 TSA 可持續下調靜止或活化的 NK 細胞表面受體NKG2D 以及 NKp46 的表達，并減少 NK 細胞表面分子CD25 的表達，導致其對 IL-2 的激活作用反應遲鈍。該研究提示我們，以 TSA 為代表的 HDACi 在治療過程中對NK 細胞有一定的負性調節作用，可能會削弱機體的免疫監視功能導致腫瘤復發。

3.4 對調節性免疫細胞的作用

調節性免疫細胞是一類控制自身免疫反應的細胞群體，包括 Treg 細胞、MDSC 細胞以及腫瘤相關巨噬細胞（TAM）等。當腫瘤發生時，這些細胞有利于機體腫瘤免疫抑制微環境的形成，抑制抗腫瘤免疫反應。Foxp3 叉狀頭結構區賴氨酸的高度乙酰化有利于 Treg 細胞獲得最佳功能，Foxp3 乙?；罂梢栽鰪娕c IL-2 啟動子的結合，從而抑制 IL-2 的表達。Do?as 等 [36]發現 TSA 可增強 Foxp3基因的表達，促進 Treg 細胞分化及增殖并增強其免疫抑制能力。MDSC 細胞是未成熟的骨髓細胞，對 T 細胞抗腫瘤免疫應答有積極的抑制作用。Rosborough 等 [37]發現聯合使用 TSA 及 GM-CSF 與單獨使用 GM-CSF 干預小鼠骨髓前體細胞培養 7 d 后，兩組細胞分化差異極大，TSA 能夠促進 MDSC 細胞的分化和增殖，表明組蛋白乙?；軌蛘{節髓系細胞向 MDSC 細胞分化。TAM 細胞表面 MHC II類分子低表達，與腫瘤進展有關。有關研究證實，TAM 細胞對 TSA 的作用相當敏感，TSA 可以恢復 TAM 細胞MHC II 類分子的表達，逆轉免疫抑制功能，延緩腫瘤的生長 [38]。總之，TSA 對調節性免疫細胞的作用不盡相同，特別是其在腫瘤中對 MDSC 細胞和 TAM 細胞的作用需要進一步探討。

4　展望

以 TSA 為代表的 HDACi 對機體免疫功能既有促進作用也有抑制作用，其正性或負性作用的產生取決于免疫細胞的類型和活化狀態。盡管 TSA 對一些免疫細胞的細胞活性和功能有負性調節作用，但越來越多的證據表明 TSA 與其他腫瘤免疫治療手段聯合使用能夠發揮較強的協同抗瘤作用。TSA 誘導腫瘤細胞特異性凋亡直接導致瘤體縮小，并且可以緩解機體免疫抑制狀態，促使腫瘤細胞更易被 NK細胞和 T 細胞識別。綜上所述，TSA 與腫瘤免疫治療的聯合使用前景廣闊，但兩者發揮協同作用的機制還需進一步探討。