馬鈴薯塊莖低溫糖化分子遺傳學研究進展

文獻標識碼：A

文章編號：1672－3635（2015）05-0301-06

收稿日期：2015-08-19

基金項目：國家自然科學基金項目（31171602）；國家馬鈴薯現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-10-P06）。

作者簡介：肖桂林（1987-），女，博士研究生，從事馬鈴薯遺傳育種研究。

*通信作者（Corresponding author）：宋波濤，教授，博士，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究，E-mail: songbotao@mail.hzau.edu.cn。

Progress in Molecular Genetics of Cold-induced Sweetening of Potato Tuber

XIAO Guilin, XIE Conghua, HUANG Wei, CAO Hongju, PENG Xiaojun, SONG Botao*

( Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (HAU), Ministry of Education/National Centre for Vegetable Improvement (Central China)/ Potato Engineering and Technology Research Center of Hubei Province/College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China )

Abstract: Fried products such as chips and French fries of potato are extremely popular food in the world, but cold-induced sweetening (CIS), a complex quantitative trait, is a main restraining factor for processing.Advances in molecular genetics make it possible to identify CIS-associated genes and develop genetic markers for trait selection through constructing linkage maps and detecting the chromosome regions where the quantitative trait locus (QTLs) located. The main progress in linkage map construction, QTL mapping and the candidate gene identification were reviewed, which lays foundation for understanding molecular mechanism of CIS and approaching the potentials of candidate gene markers in marker-assisted selection.

Key Words: potato; quantitative trait locus; cold-induced sweetening

遺傳圖譜是指通過分子標記間的連鎖關系，用遺傳距離表示分子標記在染色體上的相對位置的基因組圖，是數(shù)量性狀位點（Quantitative trait lo?cus, QTL）定位的基礎，也是實現(xiàn)分離和克隆重要基因和分子標記輔助選擇的重要途徑 [1]。

1　馬鈴薯遺傳圖譜研究進展

早在1988年，Bonierbale等 [2]就利用第一代分子標記RFLP（Restriction fragment length polymor?phism）構建出了馬鈴薯的第一張遺傳連鎖圖譜，該圖譜由134個標記組成，每條染色體上的標記數(shù)為7~18個，標記間距是0~30的圖譜單位；共12個連鎖群，分別與番茄的12個連鎖群相對應，其中9個連鎖上的標記順序與番茄相一致，充分證明了馬鈴薯與番茄之間的高度的共線性。Tanksley等 [3]利用二倍體BC1群體構建了包含1 400個RFLP標記總長度為684 cM的連鎖圖，該圖譜是迄今為止包含最多數(shù)量的RFLP標記的連鎖圖。但RFLP操作過程復雜，需要使用放射性同位素，也存在成本高和設備要求高的缺點。為了能在遺傳圖譜中利用這些信息，后續(xù)的研究常將RFLP轉換成基于PCR的標記，如序列標簽位點標記（Sequence tagged site，STS），Yamanaka等 [4]首次使用該方法，成功利用RFLP標記開發(fā)了87個STS。

擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）作為一種高效的分子標記，在馬鈴薯遺傳圖譜構建和基因定位中發(fā)揮了重要作用。首次在馬鈴薯上利用AFLP分子標記的是Herman等 [5]，他們在回交群體中檢測到264個AFLP片段，并結合已經(jīng)發(fā)表的馬鈴薯遺傳圖譜，成功將這些片段定位到染色體上。AFLP是一種結合了酶切和PCR擴增的分子標記技術，因此操作較為繁瑣。而簡單重復序列標記（Simple sequence repeat，SSR）則是一種僅依賴于PCR技術的分子標記，且廣泛分布于基因組中，多態(tài)性比例高，因而廣泛用于構建馬鈴薯遺傳圖譜。Provan等 [6]首先開展了馬鈴薯SSR標記的開發(fā)工作，19對引物可以擴增出片段，其中7對引物的擴增產(chǎn)物在18個四倍體馬鈴薯品種中未能檢測到多態(tài)性，16對引物的擴增產(chǎn)物能夠檢測出多態(tài)性，每一個位點有2~19個等位基因。兩年之后，Milbourne等 [7]從EM?BL數(shù)據(jù)庫、cDNA文庫和選擇性富集的插入DNA文庫中開發(fā)得到了112對SSR引物，其中98對引物在4個二倍體和2個四倍體中能檢測到多態(tài)性，這些SSR引物序列被后來的研究者廣泛使用。此后，F(xiàn)eingold等 [8]從The Institute for Genomic Research Po?tato Gene Index數(shù)據(jù)庫中（http://www.tigr.org）搜索并開發(fā)了94個SSR標記，將其中61個定位到了馬鈴薯遺傳圖譜上，并通過這些SSR構建了30個來自南美、北美和歐洲的馬鈴薯品種的指紋圖譜。單核苷酸多態(tài)性標記（Single nucleotide polymor?phism，SNP）是近年來發(fā)展起來的新一代分子標記，因其多態(tài)性高而得到了廣泛應用。馬鈴薯中SNP的首次報道是Rickert等 [9]在含晚疫病抗性基因區(qū)域的不同材料中，通過測序分析發(fā)現(xiàn)了127個InDels和1 498個SNP。Felcher等 [10]通過芯片共鑒定出4 400個SNP。

值得一提的是，荷蘭瓦赫寧根大學的van Os 等 [11]在2006年構建了到目前為止密度最高的馬鈴薯遺傳圖譜，作者利用包含了136個株系的二倍體F 1群體構建了雙親的遺傳圖譜，其中母本圖譜總長度為751 cM，父本圖譜總長度為773 cM，共包含了10 365個標記，除RFLP、SSR、酶切擴增多態(tài)性序列標記（Cleaved amplified polymorphic se?quence，CAPS）、序列特征性擴增區(qū)域標記（Se?quence characterized amplified region，SCAR）等60個標記之外，其余10 305個都是AFLP標記。

雖然目前用于作圖和定位的馬鈴薯群體大都為二倍體，也有利用四倍體馬鈴薯作為構建作圖群體的報道 [12]。高密度的馬鈴薯遺傳圖譜在基因定位、分子標記輔助選擇以及比較基因組學的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。

2　馬鈴薯低溫糖化QTL定位

薯片和薯條是備受人們喜愛的馬鈴薯加工食品，但出于減少常溫貯藏產(chǎn)生的塊莖失水皺縮、病蟲害傳播、發(fā)芽等現(xiàn)象及延長加工周期的目的，常將收獲后的馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下（7℃左右），而這種低溫貯藏卻常使塊莖中的淀粉轉化為還原糖，并且擴散到整個塊莖。高溫油炸加工時，塊莖中的還原糖與游離的氨基酸發(fā)生非酶促的邁拉爾德反應（Maillard reaction） [13]，致使炸片顏色變?yōu)楹谏蛘吆稚Э辔叮瑫r生成具有潛在神經(jīng)毒性、致癌性以及可誘發(fā)突變的丙烯酰胺，嚴重威脅到人的身體健康 [14,15]。生理生化研究表明，低溫糖化涉及到一系列碳水化合物的代謝，這種復雜的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡給低溫糖化抗性的遺傳學研究也帶來了極大的困擾。20世紀以來，隨著分子遺傳學的發(fā)展，馬鈴薯塊莖低溫糖化的分子遺傳學研究取得了重要進展。連鎖分析（Linkage mapping）和關聯(lián)分析（Association mapping）是當今遺傳學研究中的兩大主要研究方法，連鎖分析是經(jīng)典遺傳研究方法，關聯(lián)分析則是近年來發(fā)展起來的新型遺傳研究方法，這兩種方法均已成功運用到了馬鈴薯低溫糖化的遺傳機制解析中。

2.1　連鎖分析

Douches和Freyre [16]開創(chuàng)了低溫糖化遺傳定位研究的先河，通過（Solanum tuberosum×S. chacoense）×S. phureja構建了包含110個單株的二倍體群體，采用117個分子標記，包括10個同工酶標記、44個RFLP標記和63個隨機擴增多態(tài)DNA標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）構建了連鎖圖譜，并用單因素方差分析定位到了6個與10℃貯藏45 d時薯片色澤相關的QTL。這些QTL分布在第2，4，5和10號染色體上，可解釋43.5%的表型變異，同時發(fā)現(xiàn)上位性互作可解釋表型變異的7%。另外，研究還檢測到加性效應對炸片色澤的影響。繼該研究之后，塊莖低溫糖化性狀也大多以薯片色澤為目標性狀。

Chen [17]利用RFLP以及SCAR、CAPS標記建立了世界上第一張馬鈴薯的功能遺傳圖譜，定位了碳水化合物代謝途徑上的69個基因的85個多態(tài)性位點。這69個基因來源于淀粉合成與降解、蔗糖代謝、轉運、卡爾文循環(huán)（呼吸作用）、糖酵解、氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cy?cle，TCA）等代謝途徑。這張圖譜中關于碳水化合物代謝途徑中的候選基因標記，也用于馬鈴薯塊莖品質相關性狀的遺傳定位研究，開啟了馬鈴薯候選基因標記定位的新篇章。隨后，Menéndez等 [18]和Werij等 [19]在進行塊莖低溫糖化研究時也利用了這些候選基因標記。Menéndez等 [18]在不同的群體中，進行了不同種類糖含量的QTL定位。其構建了2個二倍體群體，鑒定了這2個群體在6個環(huán)境條件下4℃貯藏3個月后的葡萄糖、果糖以及蔗糖含量。2個群體的雙親遺傳圖譜除包含候選基因標記外，還包含了RFLP和AFLP標記。QTL定位結果顯示，葡萄糖、果糖和蔗糖含量的QTL分布于馬鈴薯的12條染色體上，且葡萄糖含量QTL和果糖含量QTL大部分是共定位的，其中效應值大于10%的QTL位于1，3，7，8，9和11號染色體上。與糖含量QTL共定位的候選基因有AGPase（腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）、Sps（蔗糖磷酸合酶）、Sus3（蔗糖合酶）、Inv-ap（胞壁轉化酶）、Sut1和Sut2（蔗糖轉運子）。Werij等 [19]同樣利用淀粉-糖代謝相關的候選基因標記構建了馬鈴薯二倍體群體的遺傳圖譜，同時在連續(xù)兩年里鑒定了包括收獲后2周、4℃貯藏3個月以及室溫回暖3周后塊莖的炸片色澤以及多個淀粉相關性狀，將炸片色澤QTL定位在了3，5，8，9和10號染色體上，3和9號染色體上的QTL分別與淀粉磷酸化酶基因StPho1a和StPho2共定位，5號染色體上的QTL與α-葡聚糖水雙激酶GWD共定位，10號染色體上的QTL與轉化酶StLin8共定位。

國內(nèi)對低溫糖化的研究起步較晚，金黎平 [20]通過雜交構建了02018二倍體群體，鑒定了從2003年開始連續(xù)3年的群體炸片色澤指數(shù)，并利用AFLP和SSR標記構建了國內(nèi)第一張馬鈴薯分子連鎖圖譜，共包含158個分子標記，17個連鎖群。QTL定位結果顯示，19個QTL分別分布在3，6，8，12，13，14，15和16號連鎖群上，解釋的表型變異幅度為5.50%~70.00%，其中效應值大于40%以上的有3個QTL，分別位于6，12和13號連鎖群上。劉杰 [21]進一步對該群體材料進行了炸片色澤的篩選，同時構建了該群體母本的AFLP遺傳圖譜，為后續(xù)更精細的定位和育種工作打下了基礎。吳艷倩 [22]也構建了二倍體馬鈴薯雜交群體，利用44 對SSR標記構建了包含12個連鎖群的遺傳圖譜，總長度為704.9 cM，平均標記間距16.0 cM，染色體上所含標記最多有9個，最少2個。通過對塊莖收獲后、低溫貯藏后以及回暖后的葡萄糖含量和蔗糖含量以及炸片色澤進行鑒定，最終將炸片顏色位點定位到了8號染色體上，解釋了80.4%的表型變異；將葡萄糖含量位點定位到了1號染色體上，解釋了64.1%的表型變異；將蔗糖含量QTL定位到了12號染色體上，對不同地點蔗糖含量解釋的表型變異百分數(shù)不同，分別是46.1%和71.2%。從上述研究中可以看出，低溫糖化在國內(nèi)的遺傳研究已經(jīng)逐步受到了重視，但在表型鑒定、定位分析，尤其是圖譜質量方面仍需要進一步完善。

2.2　關聯(lián)分析

與連鎖分析不同，關聯(lián)分析是利用自然群體中不同基因組等位基因間的連鎖不平衡（Linkage disequilibrium）關系，進行標記與性狀的相關性分析。與連鎖分析相類似的是，馬鈴薯塊莖低溫糖化關聯(lián)分析也大多采用了候選基因標記法。首先開展馬鈴薯低溫糖化關聯(lián)分析和對馬鈴薯低溫糖化關聯(lián)分析最為詳細的研究是Li等 [23-25]，首先在Menéndez等 [18]的研究結果之上，分析了定位于Sug9a（QTL）區(qū)間內(nèi)的invGE和invGF兩個細胞壁轉化酶基因與低溫糖化之間的關系 [23]。然后，通過在高世代育種系和品種材料中對馬鈴薯塊莖品質性狀和候選基因相關分析發(fā)現(xiàn)，SSSI（淀粉合成酶）、Stp23（淀粉磷酸化酶）、Dbe（淀粉脫支酶）、G6pdh（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）、Sps（蔗糖磷酸合酶）、Sus3（蔗糖合酶）、Pain1（液泡轉化酶）和AGPaseB（腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）等21個候選基因標記與塊莖品質性狀連鎖，平均每個標記解釋表型變異的12%，但不同性狀標記解釋的表型變異百分數(shù)不同，其中6個標記解釋了產(chǎn)量性狀變異的26%，10個標記解釋了塊莖淀粉含量變異的55% [24]。2013年，進一步利用育種高代系材料證明了其中5個標記GP171-a、StpL-3e、Stp23-8b、Pain1-9a和AG?PsS-10a共同調(diào)控著還原糖含量 [25]。此外，Draffehn 等 [26]在219個四倍體馬鈴薯基因型中細致分析了5個酸性轉化酶基因的等位基因多態(tài)性，利用SNP標記檢測到液泡酸性轉化酶基因Pain1的2個等位基因與薯片色澤相關。Baldwin等 [27]利用關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）和細胞壁轉化酶與馬鈴薯低溫糖化相關。

D'hoop等 [28]和D'hoop等 [29]則在沒有使用候選基因標記的情況下對薯片色澤和分子標記進行了一系列的相關性分析，首先發(fā)現(xiàn)了一些AFLP標記與薯片或薯條的色澤相關，更進一步的分析結果顯示，經(jīng)過4℃貯藏后塊莖炸片色澤相關標記位于馬鈴薯的1，6，7，8，9和12號染色體上，經(jīng)過8℃貯藏后塊莖炸片色澤相關標記位于馬鈴薯的1，2，4，5，6，9和10號染色體上，其中8℃和4℃貯藏后炸片色澤只有一個位點相重疊，該位點位于9號染色體上。大量的連鎖分析和關聯(lián)分析結果為低溫糖化抗性機制的解析奠定了基礎，同時也為候選基因的鑒定提供了依據(jù)。

3　低溫糖化QTL與候選基因標記共定位

低溫糖化過程是一個復雜的生理生化過程，不僅涉及到塊莖發(fā)育期間蔗糖的合成、運輸以及向淀粉的轉化，而且與塊莖貯藏期間淀粉降解與合成、蔗糖降解與合成、塊莖呼吸代謝等密切相關 [30]，對這種復雜的調(diào)控網(wǎng)絡的研究已經(jīng)成為塊莖品質改良研究的一個重要領域。多年來，低溫糖化QTL和候選基因標記間的共定位分析，為解析低溫糖化的遺傳機制作出了重要貢獻。

淀粉降解途徑上共定位的基因主要是GWD （α-Glucan，water dikinase）。GWD是一種結合在淀粉粒表面的雙激酶，起著磷酸化淀粉的作用，催化ATP β-磷酸轉移到支鏈淀粉中葡萄糖殘基的第3位或者第6位。同時，轉基因試驗證明，干涉GWD后不僅塊莖中的磷酸化淀粉含量降低，還原糖含量也下降，因而提高了低溫糖化抗性 [31]。Werij等 [19]通過對二倍體馬鈴薯群體進行淀粉相關性狀的QTL定位發(fā)現(xiàn)，GWD與淀粉含量、炸片色澤、直鏈淀粉含量以及淀粉糊化溫度的QTL共定位。淀粉合成途徑上共定位的基因有SSSI和AGPaseS。淀粉合酶（SS）是淀粉合成中的關鍵酶，將ADP-Glc中的Glc通過α-1,4鍵添加到糖原的非還原性末端，合成支鏈淀粉 [32]。馬鈴薯的SSⅠ基因最早在1999年克隆，但該基因在塊莖中表達量很低，主要在葉片中表達，對淀粉結構無影響。Li等 [24]通過關聯(lián)分析研究也表明SSSⅠ和炸片色澤以及淀粉含量呈正相關。AGPase是淀粉生物合成過程中第一個起關鍵性調(diào)節(jié)作用的酶，由AGPase催化G-1-P和ATP生成淀粉合成的前體物質ADP-葡萄糖，是淀粉合成過程中第一個限速步驟 [33]。AGPase由兩個亞基組成，分別由AGPaseS和AGPaseB兩個基因編碼。馬鈴薯中的AGPaseS位于1號染色體上，與糖含量或者淀粉含量相關的QTL共定位 [21]。Li等 [25]通過關聯(lián)分析證明了AGPaseS在76個BNC clones中與低溫貯藏后塊莖的炸片色澤呈正相關，與轉化酶以及淀粉磷酸化酶標記組合后，這種相關性仍然存在。

蔗糖在轉化酶的作用下轉化為葡萄糖和果糖，轉化酶抑制子會抑制轉化酶的活性，而轉化酶抑制子又與其他蛋白復合體相互作用，影響著轉化酶抑制子發(fā)揮功能，轉化酶通過這一復雜的調(diào)控網(wǎng)絡調(diào)控著低溫糖化 [25]。大量的遺傳學研究也證明了這一點，在連鎖分析中，3號染色體上的液泡轉化酶、9和10號染色體上的細胞壁轉化酶分別與Sug3a、Sug9a、Sug10a共定位 [21]。關聯(lián)分析中Li等 [24]發(fā)現(xiàn)9號染色體上的invGE和invGF在3個群體中均和低溫貯藏后塊莖炸片色澤指數(shù)相關。Draffehn等 [26]全面分析了馬鈴薯中轉化酶等位基因的變異，通過關聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)位于3號染色體上的液泡轉化酶與炸片色澤相關性最強，而細胞壁轉化酶相關性則較低。通過對不同的關聯(lián)分析證明，位于3號染色體上的液泡轉化酶、9和10號染色體上的細胞壁轉化酶均和炸片色澤顯著相關 [23-25]。

與低溫糖化共定位的轉運相關蛋白基因主要是G6pt和Sut1。G6pt是GPT中最主要的一種轉運蛋白，在異養(yǎng)組織中將葡萄糖-6-磷酸轉運到質體中，參與淀粉合成或者磷酸戊糖途徑 [34]。擬南芥葉片中的GPT2能夠感受和響應環(huán)境中光的變化，敲除掉GPT2后，淀粉合成減少，磷酸化糖含量增多。同時在擬南芥和蠶豆的種子中也檢測到GPT2的表達，通過改變種子對外源糖含量的響應調(diào)控種子的發(fā)育 [35]，是種子中淀粉合成的限速因子，調(diào)控著同化產(chǎn)物向貯藏物的轉化 [36]。Sut1是蔗糖轉運蛋白，廣泛存在于植物和真菌中，利用跨膜質子濃度梯度將蔗糖轉運到細胞質中 [37]。TypeⅠSUTs是雙子葉植物所特有的，馬鈴薯的StSUT1就是其中之一。StSUT1通過氧化還原反應與DRM（Deter?gent-resistant membrane）片段形成二聚體，同時還和PDI（Protein disulfide isomerase）互作 [38]。Sut1對馬鈴薯塊莖品質性狀的影響也已經(jīng)從遺傳學的角度得到了證實 [21]。Ant是腺苷轉運蛋白，但早期的試驗證明Ant可以將ADP-Glc轉運到淀粉體，而ADP-Glc是淀粉合成所需的糖原 [39]，Cao和Shannon [40]在玉米中發(fā)現(xiàn)腺苷轉運基因BT1的表達量和玉米胚乳中淀粉的積累相關。

Fk對應著糖酵解途徑中的丙酮酸激酶，Ppe對應著卡爾文循環(huán)中的戊糖-5-磷酸3-差向異構酶，Aco則是三羧酸循環(huán)中的順烏頭酸酶。這3個基因在各自的代謝途徑中起著重要作用，且也有研究證明糖酵解和呼吸作用中的基因在低溫糖化中發(fā)揮一定功能或差異表達 [41,42]。

雖然馬鈴薯塊莖低溫糖化遺傳機制的研究目前已經(jīng)取得長足的進展，但這些多基因的數(shù)量性狀位點是如何調(diào)控低溫貯藏期間塊莖還原糖含量的變化仍不是很清楚。基于此，本實驗室通過構建二倍體馬鈴薯F 1分離群體，并在不同年份不同地點種植后，將塊莖經(jīng)過不同處理（收獲后、低溫貯藏30 d和回暖）后測定其還原糖含量，通過QTL定位找到了不同溫度處理下的還原糖含量QTL以及不同溫度處理間的條件QTL，明確了低溫糖化和回暖過程的遺傳調(diào)控位點。同時，將候選基因標記和還原糖含量QTL進行共定位分析，明確了部分QTL區(qū)間的可能的候選基因。此外，通過分析QTL的加性效應以及QTL位點間的上位性效應，更好地闡述了馬鈴薯塊莖從收獲經(jīng)低溫貯藏再到回暖過程中還原糖含量變化的遺傳機制，為分子標記輔助育種奠定了理論基礎。