microRNAs與Toll樣受體及缺血性腦卒中的關系研究進展

譚阿蕊 綜述 韓劍虹 審校

昆明醫科大學第二附屬醫院神經內科 昆明 650101

缺血性腦卒中發病率高，病死率高，致殘率高。目前，臨床上治療缺血性腦卒中的主要手段是溶栓［1］，但由于存在治療時間窗限制，不適用于所有患者。因此，找到新的治療靶點顯得十分重要。腦缺血性損傷的病理生理機制復雜，包括氧化應激、線粒體功能障礙、興奮性毒性、凋亡基因激活、炎癥應答等，其中Toll樣受體介導的炎癥反應在腦缺血損傷的病理過程中起重要作用。本文就缺血后Toll樣受體介導的炎癥反應及其與microRNAs的關系研究進展進行綜述，旨在為尋找新的有效的治療靶點提供新思路。

1 microRNAs

microRNAs（miRNAs）是近年來發現的一類長19～23個核苷酸序列的高度保守的非編碼小RNA，通過與特定的mRNAs完全或者部分互補結合，在轉錄后水平引起mRNAs的降解或者翻譯抑制［2］，涉及多種生物學過程，包括發育、分化、固有免疫應答和適應性免疫應答等［3］。

miRNAs轉錄自外顯子與內含子之間或基因組的其他基因間區基因，首先由細胞核中DNA 轉錄成長度大約為1 kb的初級miRNAs（pri－miRNAs），然后在細胞核內經核糖核酸酶Drosha和DGCR8／Pasha蛋白剪切成60～110bp大小，形成發卡結構，稱為前體miRNAs（pre－miRNAs），前體miRNAs在核膜轉運體exportin－5協助下從細胞核中轉運到胞漿中，經另一種核糖核酸酶Dicer剪切生成長20～25bp的不完全雙鏈RNA，包括成熟miRNAs和其互補鏈。雙鏈在解旋酶的作用下解開，參與形成RNA 誘導沉默復合體（RISC）［4］。miRNAs引導RISC 與目標mRNAs的3’非翻譯區（3’UTR）互補結合，導致靶mRNA 的降解或翻譯抑制［5］。每一個高度保守的哺乳動物miRNA 可能和數百個不同的mRNA 靶向結合，因此幾乎所有的mRNA 都在某種程度上受miRNA 調控［6］。miRNAs的靶mRNAs可以通過測序的方法進行預測，但是由于存在假陽性和假陰性可能，因此預測后的結果必須通過實驗驗證。目前已發現人類腦組織表達數百種miRNA［7］，參與神經系統的發生、發育、病理生理過程。

2 TLRs的特點及其信號轉導通路

Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）是一種膜識別受體，為Ⅰ型跨膜蛋白，包括位于細胞外的富含亮氨酸重復序列區和位于細胞內的Toll／IL－1受體同源區，即TIR 區，胞外的富含亮氨酸重復序列區能與配體特異性結合，胞內的TIR區則負責接頭蛋白的募集，最終細胞激活生成大量炎性介質，是固有免疫系統的重要組成部分。目前，已發現哺乳動物TLRs家族有13 個成員（人類11 個，鼠13 個），其中，TLR2和TLR4介導腦缺血再灌注損傷病理過程中的免疫炎癥反應［8］。TLRs介導的信號轉導通路包括MyD88依賴和MyD88非依賴兩條信號通路。TLRs通過MyD88募集活化下游IRK1、IRK2、IRK4和TRAF6，導致MAPK、IRF5激活，最終激活NF－κB通路導致相關炎癥因子轉錄、釋放，即經典的MyD88依賴信號通路；MyD88非依賴信號通路不需要MyD88的介導，直接或間接通過Mal蛋白、TRAM 或TRIF等接頭蛋白募集TRADD、TRAF3、TRAF6，進而激活下游炎癥因子表達［9］。

3 TLR2／TLR4與腦缺血

炎癥反應在腦缺血性損傷過程中起重要作用，腦缺血早期在缺血半暗帶周圍小膠質細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞聚集，產生大量促炎癥因子，損傷神經元、少突細胞、細胞外基質，加重腦缺血性損傷［10］。動物實驗表明［11］，短暫性大腦中動脈閉塞導致梗死腦組織嗜中性粒細胞浸潤，24h 達 高 峰；炎 癥 相 關 分 子TLR2、TLR4、NF－κB、COX2、TNF－α顯著增加，特別是缺血后12～24h，表明TLR2／4信號通路可能通過介導炎癥反應加重缺血性腦損傷。

TLR2在中樞神經系統中主要表達于小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元和內皮細胞，主要通過MyD88依賴途徑傳遞胞外信號，激活細胞分泌炎癥因子、促炎癥因子和促凋亡因子。大鼠局部腦缺血再灌注模型和體外再灌注模型均顯示TLR2 激 活 導 致IL－23 產 生 和 小 膠 質 細 胞 分 泌IL－17，TLR2、IL－23、IL17三者形成一個信號軸，最終導致神經元凋亡增加［12］。比較大腦中動脈閉塞1h，再灌注2d的TLR2缺乏小鼠和野生型小鼠發現，TLR2缺乏小鼠腦梗死面積更小［13］，與Lehnardt等［14］研究結論一致。類似地，使用TLR2抑制劑活體阻斷TLR2可減少實驗性腦卒中小鼠腦組織白細胞和小膠質細胞浸潤和神經元死亡［15］。另外，研究表明［16］，CD36缺乏小鼠短暫大腦中動脈閉塞并不誘導炎癥因子表達，表明腦組織中清道夫受體CD36為TLR2信號通路促發的炎癥反應所必須。因此，TLR2－CD36復合體是腦缺血后炎癥反應的重要觸發點。

腦TLR2表達在嚙齒動物短暫和永久性局部腦缺血模型和體外缺血模型中均增加。TLR2上調和TLR2信號通路通過介導炎癥反應加重缺血性腦損傷。然而，關于TLR2在缺血性腦損傷中的作用有爭議性報道。Hua等［12］發現，小鼠急性局部腦缺血再灌注后，與野生型小鼠相比，TLR2KO小鼠病死率更高，神經功能缺失更多，腦梗死面積更大，TLR2似乎通過增加保護性信號激活在腦缺血再灌注中起保護作用；使用TLR2配體預處理小鼠24h能對腦缺血起到明 顯 的 保 護 作 用［17］。TLR2 激 動 劑Pam3CSK4 可 通 過TLR2－PI3K／Akt依賴途徑顯著減輕局部腦缺血性損傷［18］。實驗結果不一致可能是由于實驗動物模型、動物體質量、用于動脈閉塞的線栓直徑及涂層、缺血再灌注時不一致所致。

TLR4是在哺乳動物中發現的第1個TLR，在中樞神經系統中，TLR4主要表達于神經膠質細胞，特別是小膠質細胞。除MyD88 依賴途徑和非依賴途徑，TLR4 還通過MAPKs信號通路途徑介導細胞增殖、分化和凋亡。動物模型研究顯示［12］，TLR4KO 小鼠在急性腦缺血再灌注后梗死面積更小，神經功能缺失減少，表明TLR4在腦缺血再灌注損傷病理過程中加劇腦損傷。短暫性腦缺血小鼠模型腦小膠質細胞TLR4表達也上調。對不同種屬TLR4KO 小鼠進行研究發現［8］：（1）和野生型小鼠相比，TLR4KO 小鼠梗死面積顯著減小，神經功能評分提高，而TLR3，TLR9KO 小鼠不會改變；（2）和野生型小鼠相比，TLR4KO 小鼠缺血區域CD11b陽性小膠質細胞數減少，NF－κB 激活減少；（3）TLR4缺乏小鼠腦炎癥和損傷相關介質表達更少，包括IRF1、IFNβ、iNOS、MMP－9、COX2，證實了TLR4可通過介導炎癥反應加劇腦損傷。

4 TLRs與miRNAs相互調控

TLRs信號通路的信號分子受許多機制調節，包括物理相互作用、構象改變、磷酸化、泛素化和蛋白酶體介導的降解［19］，但更為節能的方式是通過mRNA 降解或調節TLR 信號分子的表達。隱孢子蟲感染通過MyD88／NF－kB 依賴的方式減少miRNA－let－7的表達，同時增加TLR4 的表達，過表 達miRNA－let－7 顯 著 增 加TLR4 蛋 白 的 表 達［20］，表 明miRNA－let－7對TLR4存在調控作用。已證實，miRNAs能在多個水平調控TLR 信號通路，包括：（1）調控TLRs表達，如TLR4表達受miR－223、let－7i、let－7e的調控，TLR2表達受miR－105調控；（2）作用于通路信號分子，如miR－155作用于MYD88，miR－146作用于IRAK1、IRAK2、TRAF6等；（3）作用于轉錄因子，如miR－9作用于NF－κB1等；（4）作用于細胞因子mRNAs，如let－7作用于IL－6 mRNA、miR－155作用于TNF mRNA 等；（5）作用于TLR 信號通路調節劑相關基因，如miR－132調控ACHE編碼基因等［21］。

實驗發現，給予TLR4配體LPS，可增加單核細胞miR－146a、miR－155 和miR－132 的 表 達［22］。然 而，TRAF6 和IRAK－1是miR－146的靶點，是TLR 介導的NF－kB激活的重要分子。表明miR－146可能是固有免疫和炎癥應答TLR 通路中的負反饋調節分子。動物實驗證實，TLR4和TLR2激活巨噬細胞，上調miR－125a－5p，而TLR3 不行。MiR－125a－5p是巨噬細胞相關炎癥應答的負性調節分子［23］。大量研究表明［21］，TLR4可上調miR－155、miR－146、miR－132、miR－21、miR－223、miR147、miR－9、miR－125b、let－7e、miR－27b，下 調miR－125b、let－7i、miR－98；TLR2 可 上 調miR－155、miR－146、miR－147、miR－9。

5 缺血性損傷中miRNA 與TLRs的調控關系

TLRs介導的過度免疫炎癥反應在缺血再灌注引起的組織損傷中發揮重要作用，但其機制尚未完全明了。在小腸缺血再灌注損傷研究中發現，IRAK1 聚集將引發小腸缺血再灌注引起的上皮免疫高反應，而miR－146a可以控制IRAK1上調，阻止免疫高反應［24］，說明miR－146a在小腸缺血再灌注中可通過TLR 信號通路減輕免疫炎癥反應，減輕再灌注損傷。在肝臟缺血再灌注損傷研究中也有類似的發現，肝再灌注24h中肝miR－146a的表達下調，再灌注6h達最低。再灌注24h中TLR4，TRAF6，IRAK1 隨miR－146a的減少而增加，6h 達 高 峰，提 示 在 肝 再 灌 注 損 傷 中，miR－146a 與TLR4可能存在調控關系［25］。另外，在心肌缺血再灌注損傷研究中發現［26］，增加miR－146a表達可以減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制可能為通過抑制IRAK1 和TRAF6 而減少NF－kB激活和炎癥因子產生。此外，Santra等［27］通過細胞模型試驗證實，胸腺素β4可通過上調miR－146a促進少突膠質細胞分化，抑制IRAK1和TRAF6表達，從而抑制TLR 促炎癥通路。

6 展望

神經系統許多miRNA 表達具有時序性，表明其參與神經系統發生、發育、生理和疾病過程。現已有研究證實，miR－146a是星形膠質細胞介導的炎癥反應的負反饋調節劑。據此我們可以推測，miR－146a可能也在腦缺血性損傷中通過TLR 信號通路影響炎癥因子表達。但目前miRNAs對炎癥反應TLR 信號通路的調控在缺血性腦損傷研究中還未見報道。深入了解缺血性腦卒中病理過程中miRNAs的作用和靶點，有助于為缺血性腦卒中的預防、診斷和治療提供新的方法和靶點。目前，關于miRNAs在免疫炎癥反應中的調控機制和生物學功能已作了大量研究，但還未完全明了，其在缺血性腦卒中中的具體機制需要進一步研究闡明。miRNAs在缺血性腦卒中的治療上具有廣闊的前景，隨著miRNAs不斷被發現，更多的調控關系被證實，通過干預缺血性腦卒中病理過程不同環節的miRNAs表達以減輕腦損傷，對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

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