利用NOD小鼠構建I型糖尿病模型的研究進展

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利用NOD小鼠構建I型糖尿病模型的研究進展

萬繼亞，劉巖厚，王軼楠*

(吉林大學第一醫院轉化醫學研究院，吉林 長春130061)

I型糖尿病(Type I diabetes，TID)是由遺傳因素和環境因素共同介導產生的自身免疫性疾病，以自體激活的T淋巴細胞對分泌胰島素的胰島β細胞的進行性破壞為特征，最終導致胰島素不足、血糖調節異常、持續高血糖狀態和相關并發癥出現，是一種復雜的代謝性疾病。流行病學研究表明，TID占糖尿病患者總數的10%左右，每年全球增長率約為3%[1,2]。該文主要就應用基因調控NOD小鼠構建人TID動物模型，從胰島β細胞保護機制、自身免疫性T細胞活化調控機制、誘導外周耐受機制、以及利用模擬人TID的免疫系統人源化小鼠模型，針對人免疫細胞靶點的治療方案開發等方面加以綜述。

1利用NOD小鼠構建TID模型概況

在構建TID動物模型的早期階段，主要是通過非免疫學機制(如手術或藥物)導致胰島β細胞損傷，產生胰島素分泌障礙、持續高血糖狀態等類似糖尿病的癥狀。常用藥物有四氧嘧啶(Alloxan)和鏈脲佐菌素(Streptozotoein，STZ)，這兩種藥物引起β細胞損傷的機制雖然不同，但主要都是通過誘導產生大量的氧自由基造成β細胞損傷，動物都有血糖升高，血糖降低，持續高血糖三個時相的變化，但模型制備的成功與否受很多因素影響，如動物選擇、給藥劑量、給藥途徑等；并且此類模型雖然能夠引起高血糖等癥狀，可用于研究高血糖所引起的并發癥，但并不能反映TID真正的發病機制。

1980年Tochino等通過近親交配和選擇繁殖獲得了一種純系的自發性非肥胖糖尿病(nonobese diabetic，NOD)小鼠,其發病特征和病理學變化與人的糖尿病很相似[3]。雌性NOD小鼠在3周齡時開始出現自身免疫性胰島炎，伴有巨噬細胞、DC以及B、T淋巴細胞胰島內浸潤，12至16周齡開始因嚴重胰島β細胞破壞而出現糖尿病癥狀，在30周齡時發病率可達到60%-80%；雄性NOD小鼠在稍晚期發病，發病率在20%-30%左右。組織學研究顯示，糖尿病出現癥狀前，胰島先有大量的淋巴細胞浸潤，開始分布在胰島細胞周圍或部分胰島細胞內，以后逐漸蔓延到腺管和血管周圍，胰島β細胞腫脹、排列紊亂、細胞數目逐漸減少，以至在后期完全消失。免疫組織化學研究提示胰島浸潤的細胞主要為T淋巴細胞。

NOD小鼠對于糖尿病的基因易感性是由多個基因位點決定的，其中最為重要的是獨特的MHC單倍體H-2g7，由于Ea基因啟動子區域的缺失，這一單倍體不表達I-E分子，而是表達I-A分子[4]。與人類糖尿病易感基因同樣，NOD小鼠的糖尿病易感基因屬于MHC的II類分子。進一步研究發現NOD小鼠的TID也是由T細胞介導的，B細胞在此過程中作為抗原提呈細胞發揮作用，而不是介導體液免疫反應。基于NOD小鼠糖尿病的自發性、發病率的穩定性、相似的病理學改變和遺傳學基礎，以及相似的免疫學發病機制，利用NOD小鼠構建TID模型已經廣泛深入的用來探討人TID的發病機制及臨床診療手段的開發。

2胰島β細胞保護機制的研究

在TID的發生發展過程中，胰島β細胞的損傷是由不同的免疫細胞多重浸潤造成的，抗原提呈細胞，如巨噬細胞、DC等分泌炎性介質(TNF-α、IFN-γ、IL-1β和活性氧自由基等)誘導胰島炎癥的發生和胰島β細胞的損傷；進而這些抗原提呈細胞處理自身抗原并提呈給T細胞，誘導細胞介導的免疫反應，通過釋放各種細胞毒性因子，如炎性細胞因子、顆粒酶、穿孔素等選擇性殺傷胰島β細胞；還可以通過Fas途徑直接誘導胰島β細胞的死亡[5,6]。各種基因調控NOD小鼠已被用來構建TID模型研究胰島β細胞損傷的機制及防治策略。

2.1　調控效應T細胞功能保護胰島β細胞的研究

效應T細胞介導胰島β細胞的機制主要包括炎性細胞因子的分泌、FasL-Fas信號通路誘導的細胞凋亡、顆粒酶、穿孔素的分泌等[7,8]。有研究發現lpr突變Fas缺失的NOD小鼠不產生糖尿病癥狀，患病小鼠細胞轉輸也不能誘導發生糖尿病，表明在胰島β細胞損傷中FasL-Fas途徑很重要[9]；因此有研究者構建了胰島素啟動子調控的胰島β細胞過表達FasL的NOD小鼠，發現這種小鼠出現較重的糖尿病，并對效應T細胞敏感性增強，推測在胰島炎過程中產生的細胞因子可能誘導了胰島β細胞表面Fas的表達，與轉基因的FasL發生交聯，從而導致對胰島β細胞自身的自殺性攻擊效應[10]。

T細胞活化需要雙重信號，首先是T細胞受體識別MHC復合體提呈的特異性抗原肽，其次還需要共刺激分子的參與。正面的共刺激信號促進T細胞增殖和細胞因子的分泌，負面的共刺激信號誘導T細胞發生耐受[11]。在研究胰島中浸潤的效應T細胞功能調控中，研究者構建了胰島β細胞特異性的由胰島素啟動子調控的過表達各種相關基因的NOD小鼠，發現負向調節分子PD-L1(Programmed death-1)的過表達會降低糖尿病的嚴重程度，抑制糖尿病的進展[12]。

2.2　調控細胞因子網絡保護胰島β細胞的研究

在TID發生發展過程中，促炎性細胞因子和Th1細胞分泌的細胞因子與疾病進展密切相關，而抗炎性細胞因子，如IL-4、IL-10、TGF-β等則有保護作用。研究者構建了多種胰島特異性細胞因子轉基因NOD小鼠，以期闡明各種細胞因子在胰島微環境下對于胰島β細胞和浸潤的淋巴細胞的不同作用。研究表明，在胰島素啟動子下游過表達IL-4、TGF-β會抑制NOD小鼠胰島炎和糖尿病的發生[13]。胰島局部產生的IL-10加速糖尿病的發生、延長維持時間，而系統性應用IL-10則會有效防止糖尿病的發生，提示除了免疫抑制效應外，IL-10可能還有其他生物學作用，并且這些作用與IL-10分泌的時間、部位、受其影響的細胞類型都密切相關[14,15]。IL-35是IL-12家族的成員，研究表明IL-35具有抑制效應性T細胞的作用，胰島β細胞上IL-35的過表達會減少NOD小鼠胰腺中T細胞的浸潤和局部增殖，防止糖尿病的發生[16]。

2.3　調控趨化因子網絡保護胰島β細胞的研究

在炎癥過程中，趨化因子能夠募集炎性效應細胞到達局部并發揮免疫活性，在TID發展進程中，樹突細胞、巨噬細胞、炎癥部位的胰島細胞都能夠分泌趨化因子，引起胰島局部淋巴細胞的大量浸潤。研究表明，在胰島局部通過異位表達趨化因子的受體中和趨化因子的作用，可以減輕淋巴細胞的浸潤，防止糖尿病的發生。胰島中炎性趨化因子的偽受體D6的過表達能夠有效減少效應T細胞在胰島部位的集聚，進而抑制T細胞活化造成的損傷[17,18]。

因此，應用NOD小鼠構建TID模型，通過在胰島細胞特異性表達免疫調節分子，將有助于深入闡明在TID的發生發展過程中，淋巴細胞募集到胰島局部，發揮免疫殺傷效應的機制，并有助于免疫治療策略的設計和開發。

3TID自身免疫機制的研究

NOD小鼠的糖尿病易感基因屬于MHC的II類分子，在糖尿病的發生發展過程中，自體活化的CD4T細胞發揮重要作用。為明確TID發病的自身免疫機制，由易感基因H-2g7提呈的多種胰島自身抗原反應性T細胞被克隆鑒定，并建立了相應的T細胞受體庫，進而構建多種T細胞受體轉基因小鼠。應用自體反應性CD4T細胞克隆BDC2.5構建的T細胞受體轉基因小鼠在三周內即可發生胰島炎，要明顯早于野生型的NOD小鼠，但并不顯示出糖尿病的易感性，只有將其構建于NOD/SCID品系后，四周齡小鼠就會發生嚴重的胰島炎和糖尿病[19]。

CD8T細胞缺陷的小鼠不會發生胰島炎和糖尿病表明CD8T細胞同樣參與胰島β細胞損傷。為明確TID自身免疫機制中CD4T細胞與CD8T細胞的相互作用，胰島特異性CD8T細胞克隆NY8.3被用來構建轉基因NOD小鼠，這種小鼠與非轉基因NOD小鼠相比較早發生糖尿病的癥狀，將NY8.3轉基因構建到RAG2缺陷，沒有CD4T細胞的NOD背景小鼠之后，糖尿病的發病率明顯降低，發病晚于對照組小鼠，表明CD4T細胞在自身免疫性糖尿病發病中的優勢作用[20]。

糖尿病抗原特異性T細胞受體轉基因小鼠除了可以進行自身免疫機制的體內研究，也可以分離足夠數量針對某個特異性抗原的原始T細胞，體外觀察其在不同因素影響下的向Th1、Th2、 Th17、Treg等方向的分化情況，闡明CD4T細胞在糖尿病中的作用機制。然而，基于糖尿病抗原的多樣性，應用單一一種抗原特異性CD4T或CD8T細胞受體的轉基因小鼠對于體內免疫機制的研究也有其過于簡單化的局限性，需要結合多種因素進行結果的綜合判斷與分析。

4TID外周免疫耐受機制的研究

TID是由遺傳因素和環境因素共同影響的自身免疫性疾病，以外周免疫耐受被打破，T淋巴細胞發生針對自體抗原的免疫反應為重要特征，因此TID外周免疫耐受機制的研究對于TID的免疫治療方案的開發非常重要。體內的自體活化T細胞在中樞由胸腺中發生的負選擇機制誘導凋亡來排除，在外周主要由發揮免疫調節作用的細胞來對抗其作用[21]。

為研究TID外周免疫耐受機制，研究者構建了多種胰島特異性表達外來抗原的轉基因NOD小鼠，這些小鼠胰島β細胞表面外來抗原的表達(主要是病毒蛋白成分)并不會誘導T細胞介導的對胰島細胞的破壞，然而，當應用相關病毒感染這些小鼠時，外周耐受將會被打破，從而產生針對胰島β細胞的破壞，發生糖尿病[22]。TID的發生已經被證明與病毒感染密切相關，如腸病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、細小病毒等。其中在糖尿病患者體內，最常見的病毒是屬于腸病毒的柯薩奇病毒，這種病毒會感染多種組織，導致嚴重的胰島炎，并最終通過分子模擬機制或旁觀者效應激活T細胞，誘導自身免疫性糖尿病的發生[23]。這樣，在TID的發病中，抗原提呈細胞的成熟和活化狀態也是外周免疫耐受打破的重要環節。因此，應用NOD小鼠構建轉基因模型，可以深入探討環境中的病毒感染、基因變異和個體免疫反應等多種因素對于TID發病的共同作用機制。

5人源化MHC轉基因小鼠

糖尿病的基因學研究已鑒定出與糖尿病易感性密切相關的60個以上的基因位點，超過90%以上的糖尿病患者都擁有獨特的MHC型別。與NOD小鼠的MHC單倍體H-2g7類似，人類的糖尿病易感基因位點為MHC-II類分子HLA-DQ8。以明確的疾病基因易感性為基礎，研究者構建了多種人源化MHC轉基因小鼠，深入探討了特異性T細胞受體/抗原肽/MHC分子的相互作用在疾病發展中的影響機制。

DQ8轉基因NOD小鼠中CD4+T細胞絕大多數為DQ8限制性T細胞，可用來鑒定相對應的與自身抗原特異性結合的T細胞表型。除了DQ8基因位點之外，DR4也是重要的糖尿病易感基因位點，并與DQ8呈現明顯的連鎖不平衡現象。為解析這兩個疾病易感基因位點在TID中的作用，Wen等人構建了DR4、DQ8轉基因NOD小鼠，發現DR4轉基因小鼠、DR8、DR4共同轉基因表達小鼠的TID發病率顯著低于DQ8轉基因小鼠，顯示DR4分子對于DQ8的糖尿病易感效應可能起到負調節的作用[24]。這些人源化MHC轉基因小鼠能夠促進疾病易感性MHC分子相應的自身抗原的鑒定，促進了TID分子機制的闡明和疾病預防相關的基因預測方案的開發[25]。

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(收稿日期：2014-07-02)

文章編號：1007-4287(2015)07-1234-03

*通訊作者